Plazmid DNA'sının Fare İskelet Kasına Elektroporasyonu
Summary
Plazmid DNA’sının iskelet kasına elektroporasyonu, farelerde kas kontraktilitesinden ödün vermeden gen ekspresyonunu modüle etmek için uygun bir yöntemdir.
Abstract
Plazmid elektroporasyonu ile murin iskelet kasında geçici gen ekspresyon modülasyonu normal ve patolojik fizyolojinin değerlendirilmesinde yararlı bir araçtır. Hedef genlerin aşırı ekspresyonu veya yıkılması, araştırmacıların bireysel moleküler olayları manipüle etmelerini ve böylece kas kütlesini, kas metabolizmasını ve kontraktiliteyi etkileyen mekanizmaları daha iyi anlamalarını sağlar. Ek olarak, floresan etiketlerini kodlayan DNA plazmidlerinin elektroporasyonu, araştırmacıların iskelet kasındaki proteinlerin hücre altı lokalizasyonundaki değişiklikleri in vivo olarak ölçmelerini sağlar. İskelet kasının anahtar fonksiyonel değerlendirmesi, kas kontraktilitesinin ölçülmesini içerir. Bu protokolde, plazmid DNA enjeksiyonu, elektroporasyon ve gen ekspresyon modülasyonundan sonra tüm kas kontraktilitesi çalışmalarının hala mümkün olduğunu gösteriyoruz. Bu eğitici prosedürün amacı, tibialis anterior ve ekstansör digitorum longus kaslarının miyoliflerinde alım ve ekspresyonu kolaylaştırmak için fare iskelet kasına DNA plazmid elektroporasyonunun adım adım yöntemini göstermek ve iskelet kası kontraktilitesinin enjeksiyon ve elektroporasyon ile tehlikeye atılmadığını göstermektir.
Introduction
İskelet kası içine plazmid DNA elektroporasyonu in vivo olarak iskelet kası fizyolojisindeki değişiklikleri ve moleküler sinyallemeyi değerlendirmek için çeşitli fizyolojik ve patofizyolojik koşullarda gen ekspresyonunu modüle ederek önemli bir araçtır 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . İskelet kasına deneysel gen transferi, Wolff ve ark. tarafından 1990 gibi erken bir tarihte gösterilmiştir; burada hem RNA hem de DNA elektroporasyon olmadan başarılı bir şekilde aktarılmış ve lusiferaz ekspresyonu en az 2 ay boyunca korunmuştur10. Sadece enjeksiyonla nispeten düşük transfeksiyon etkinliği sorunludur ve Aihara ve Miyazaki, 1998 yılında bir pCAGGS-IL-5 yapısını tibialis anterior (TA) kasına elektroporasyon yaparak ve serum IL-5 ekspresyonu11’i ölçerek elektroporasyon ile artan gen transferini göstermiştir. O zamandan beri, birçok çalışma, maksimum gen transfer verimliliğini sağlamak için farklı DNA konsantrasyonlarının, hacimlerinin ve elektroporasyon parametrelerinin etkinliğini araştırmıştır. Mir ve ark. voltaj, darbe sayısı, nabız süresi ve frekansın yanı sıra DNA konsantrasyonu da dahil olmak üzere farklı elektroporasyon parametrelerini test ettiler ve daha fazla voltaj, darbe sayısı ve DNA konsantrasyonunun hepsinin elektroporasyon verimliliğinin artmasına katkıda bulunduğunu belirlediler12. Yüksek elektroporasyon voltajına yapılan önemli bir uyarı, miyoliflere artan DNA alımını kolaylaştırırken, aynı zamanda sonuçları karıştırabilecek kas hasarına neden olmasıdır. Schertzer ve ark., 200 V’ta elektroporasyonun, elektroporasyondan 3 gün sonra miyoliflerin yaklaşık% 50’sinde hasara neden olduğunu, oysa miyoliflerin sadece% 10’unun 50 V13’te hasar gördüğünü göstermiştir. Etkili DNA transferini etkileyen değişkenleri kas hasarına karşı dikkate aldık ve etkili gen transferini gerçekleştirmek için santimetre kaliper genişliğinde 125 V’luk bir voltajın yeterli olduğunu bulduk.
Elektroporasyon sonrası kas lifi kesit alanının ve tüm kas kontraktilitesinin analizi, gen modülasyonuna bağlı kas büyüklüğü ve fonksiyonundaki değişiklikleri ölçme yönteminin önemli yönleridir. Biz ve diğerleri daha önce kontrol vektörlerinin elektroporasyonunun tek başına miyofiber alanda bir azalmaya neden olmadığını göstermiştir. Yeşil floresan protein (EGFP) yapısı, bu çalışmalarda DNA transfeksiyonunun yararlı bir floresan göstergesiydi13,14. Bir dizi çalışma, elektroporasyon sonrası TA’nın in situ kontraktilitesini araştırmış ve değişen sonuçlar bulmuştur. Bir çalışma, 75 V / cm elektroporasyonun, elektroporasyondan 3 gün sonra tetanik kuvvette yaklaşık% 30’luk bir azalmaya neden olduğunu ve elektroporasyondan 7 gün sonra, tetanik kuvvetin kontrol seviyesine geri döndüğünü, 50 V / cm elektroporasyonun ise kuvvet 13,15’ten ödün vermediğini göstermiştir. Başka bir çalışma, 180 V / cm elektroporasyondan 3 saat sonra% 30’luk bir tetanik kuvvet kaybı olduğunu ve 7 gün16’dan sonra sahte kuvvet seviyelerine geri döndüğünü göstermiştir.
Aşağıdaki ayrıntılı prosedürde, farelerin TA ve ekstansör digitorum longus (EDL) kaslarında bir pcDNA3-EGFP plazmidinin enjeksiyonunu ve elektroporasyonunu gösteriyoruz. Ayrıca bu yöntemin EDL tüm kas kontraktilitesini etkilemediğini de gösteriyoruz. Amaç, fonksiyon kaybına neden olmadan miyoliflere etkili plazmid alımını göstermektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Elektroporasyon ile güçlendirilmiş iskelet kasında in vivo gen transferi, kastaki protein ekspresyonunu modüle etmek için yararlı ve nispeten basit bir araçtır. EDL ve TA kaslarında etkili gen transferi sağlamak için gereken adımları gösterdik ve EDL’nin kontraktilite ölçümünün prosedürü takiben uygulanabilir olduğunu gösterdik. Bu teknik daha karmaşık viral vektörler gerektirmez ve tek bir kasta transfekte ve transfekte olmayan kas lifi kesit alanının karşılaştırılmasına izin …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hiç kimse
Materials
| 4-0 Nylon suture (non-absorbable) | Ethicon | 662G | Suture to close skin incision |
| 50µl Hamilton syringe | Hamilton | 80501 | microsyringe |
| C57BLl/6NHsd mice | Envigo | 044 | 12 week-old female mice used for experimentation |
| Caliper Electrode | BTX | 45-0102 | 1.0cm x 1.0cm stainless steel |
| Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis | Aurora Scientific | 605A | Software used for muscle contractility measurement and analysis |
| ECM 830 Electroporation System | BTX | 45-0662 | electroporator |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
| Extra Narrow Scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Scissors for blunt dissection |
| Force Transducer | Aurora Scientific | 407A | To measure force from EDL |
| Micro-Masquito Hemastats | Fine Science Tools | 13010-12 | Hemastats for surturing |
| pcDNA3.1 mammalian expression vector | Fisher Scientific | V79020 | Control Vector |
| pcDNA3-EGFP expression plasmid | Addgene | 13031 | Plasmid for GFP expression |
| Semken curved forceps | Fine Science Tools | 11009-13 | Forceps for surgery |
| Surgical blades stainless steel no. 10 | Becton Dickinson | 37 1210 | Scalpel blades |
| Tissue-Tek O.C.T. media | VWR | 25608-930 | Freezing media for histology |
| Wheat Germ Agglutinin- Texas Red | Thermo-Fisher Scientific | W21405 | Membrane staining for muscle cross section |
References
- Dodd, S., Hain, B., Judge, A. Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats. Biogerontology. 10, 605-611 (2009).
- Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse. Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).
- Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. Hsp27 inhibits IKKβ-induced NF-κB activity and skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).
- Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication. American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).
- Houston, F. E., et al. Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).
- Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy. The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).
- Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).
- Blaveri, K., et al. Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers. Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).
- Fewell, J. G., et al. Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation. Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).
- Wolff, J. A., et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).
- Aihara, H., Miyazaki, J. Gene transfer into muscle by electroporation in vivo. Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).
- Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).
- Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function. Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).
- Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).
- Schertzer, J. D., Lynch, G. S. Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation. Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).
- Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).
- Hain, B. A., et al. Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).
- Hain, B. A., et al. REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice. Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).
- Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).
- Waning, D. L., et al. Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice. Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).
- Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Reports. 4, 732 (2015).
- Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70. American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).
- Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo. Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).
- Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle. Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).
- Molnar, M. J., et al. Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles. Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).
