मिट्टी की अपारदर्शिता के कारण, इसके घटक रोगाणुओं के बीच बातचीत को सेलुलर रिज़ॉल्यूशन के साथ आसानी से कल्पना नहीं की जा सकती है। यहां, दो माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण प्रस्तुत किए जाते हैं, जो फंगल-माइक्रोबियल इंटरैक्शन की जांच के लिए नए अवसर प्रदान करते हैं। उपकरण बहुमुखी और उपयोग करने में सरल हैं, जो सेलुलर स्तर पर उच्च स्थानिक नियंत्रण और उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को सक्षम करते हैं।
फिलामेंटस कवक मिट्टी के सफल निवासी हैं और मिट्टी के पारिस्थितिक तंत्र में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं, जैसे कि कार्बनिक और अकार्बनिक पदार्थों के अपघटन के साथ-साथ पोषक तत्वों के स्तर का विनियमन। वहां उन्हें बैक्टीरिया या अन्य कवक जैसे विभिन्न अन्य रोगाणुओं के साथ बातचीत करने के कई अवसर भी मिलते हैं। सेलुलर स्तर पर फंगल इंटरैक्शन का अध्ययन करना, हालांकि, मिट्टी की ब्लैक बॉक्स जैसी प्रकृति के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है। फंगल इंटरैक्शन के अध्ययन के लिए नए माइक्रोफ्लुइडिक टूल विकसित किए जा रहे हैं; बैक्टीरियल-फंगल और फंगल-फंगल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन किए गए दो प्लेटफार्मों पर प्रकाश डाला गया है। इन माइक्रोचैनलों के भीतर, फंगल-माइक्रोबियल इंटरैक्शन को पहले से संभव की तुलना में उच्च अस्थायी और स्थानिक रिज़ॉल्यूशन पर नियंत्रित भौतिक-रासायनिक वातावरण में निगरानी की जा सकती है। इन उपकरणों के अनुप्रयोग ने कई उपन्यास जैविक अंतर्दृष्टि प्राप्त की हैं, जैसे कि हाइप के लिए बैक्टीरिया ध्रुवीय लगाव का अवलोकन या अनिर्दिष्ट कवक-कवक विरोध का खुलासा करना। इन पद्धतियों की एक प्रमुख विशेषता गैर-विशेषज्ञों द्वारा इस उपकरण के उपयोग में आसानी का संबंध है, जो सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में उपयोग के लिए अत्यधिक अनुवाद योग्य प्रौद्योगिकियों का उत्पादन करती है।
मिट्टी एक असाधारण विविध वातावरण है जिसमें सूक्ष्मजीवों की बहुतायत होती है जो कार्बन और फॉस्फोरस चक्र 1,2 के लिए सहायक होती है। फिलामेंटस कवक कार्बनिक और अकार्बनिक पदार्थों के डीकंपोजर के रूप में कई पारिस्थितिक तंत्रों का एक प्रमुख घटक है और सहजीवी संबंधों 3,4 के गठन के माध्यम से पौधों के पोषण को बढ़ा सकता है। मिट्टी के भीतर, कवक रोगाणुओं की एक भीड़ के साथ गतिशील रूप से बातचीत करता है जैसे कि अन्य कवक5, बैक्टीरिया6, वायरस7 और नेमाटोड8। इन इंटरैक्शन के मिट्टी और पौधों के स्वास्थ्य के लिए महत्वपूर्ण परिणाम हैं। फिर भी, उच्च-रिज़ॉल्यूशन के साथ सूक्ष्मजीवों को बातचीत करने में सक्षम उपयुक्त प्रयोगात्मक प्रणालियों की कमी के कारण, कई अपरिभाषित रहते हैं।
बैक्टीरियल-फंगल इंटरैक्शन (बीएफआई) और फंगल-फंगल इंटरैक्शन (एफएफआई) से संबंधित जांच में कई क्षेत्रों में मूल्यवान अनुप्रयोग हैं, जिनमें चिकित्सा में रोगाणुरोधी और कृषि में जैविक नियंत्रण एजेंट शामिल हैं। उदाहरण के लिए, कवक कोप्रिनोप्सिस सिनेरिया पेप्टाइड कॉप्सिन का उत्पादन करता है, जिसे मानव रोगज़नक़ लिस्टेरिया मोनोसाइटोजेनेस9 के खिलाफ जीवाणुरोधी गतिविधि प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है। इसी तरह, फंगल-व्युत्पन्न यौगिक, ग्रिसोफुल्विन, व्यापक रूप से मानव फंगल संक्रमण के उपचार के रूप में उपयोग किया जाता है और इसके अतिरिक्त पौधे रोगजनक कवक अल्टरनेरिया सोलानी10,11 के विकास को बाधित करने में सक्षम है। मिट्टी में रहने वाले जीवाणु बैसिलस सबटिलिस के कई उपभेदों को फंगल प्लांट रोगज़नक़ राइजोक्टोनिया सोलानी12,13 के प्रभावी जैव नियंत्रण एजेंटों के रूप में भी प्रदर्शित किया गया है। बहरहाल, पारंपरिक पद्धतियों से जुड़ी सीमाओं के कारण, बीएफआई और एफएफआई को एकल कोशिकाओं के स्तर पर खराब समझा जाता है।
पारंपरिक अध्ययन आमतौर पर टकराव में दो या दो से अधिक प्रजातियों के साथ अगर प्लेटों का उपयोग करके मैक्रोस्केल पर बीएफआई और एफएफआई का पता लगाते हैं। उनकी बातचीत का मूल्यांकन14,15,16 प्रजातियों की वृद्धि दर और मेटाबोलाइट उत्पादन को मापकर किया जाता है; हालाँकि, इस पद्धति को केवल कॉलोनी स्तर तक हल किया जाता है। सेलुलर स्तर पर बातचीत का अध्ययन करने के लिए, बैक्टीरिया और फंगल इनोकुलेंट्स को अगर के साथ लेपित ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर खेती की जा सकती है जो तब माइक्रोस्कोप17 के तहत इमेज किए जाते हैं। फिर भी, कारावास की कमी के कारण माइक्रोस्कोप स्लाइड का उपयोग करके एक एकल हाइफा का पालन करना मुश्किल हो सकता है, जिसका अर्थ है कि समय-चूक छवियों को प्राप्त करना कठिन है। इसके अलावा, फंगल मायसेलियम के परिभाषित क्षेत्रों के भीतर अन्य सूक्ष्मजीवों को स्थानिक रूप से सीमित करने या परिभाषित रासायनिक वातावरण बनाने का अवसर जो परेशान हो सकता है, उदाहरण के लिए, ऐसे सेट-अप में संभव नहीं है। मिट्टी की “ब्लैक बॉक्स” प्रकृति एकल कोशिकाओं18 के स्तर पर फंगल-माइक्रोबियल इंटरैक्शन का अध्ययन करने की जटिलता को भी जोड़ती है। मिट्टी माइक्रोबायोम की अविश्वसनीय विविधता से दूर बातचीत करने वाली प्रजातियों को देखकर, व्यक्तिगत सदस्यों के बातचीत करने के सटीक तरीके का आकलन किया जा सकता है। इस प्रकार, बहुमुखी प्लेटफार्मों की निरंतर आवश्यकता है जो बीएफआई और एफएफआई के उच्च-रिज़ॉल्यूशन, सिंगल-सेल इमेजिंग को सक्षम करते हैं।
माइक्रोफ्लुइडिक प्रौद्योगिकियां, तथाकथित लैब-ऑन-ए-चिप सिस्टम, एकल कोशिकाओं के स्तर पर बीएफआई और एफएफआई के अध्ययन के लिए एक आदर्श मंच प्रदान करती हैं। रासायनिक विश्लेषण और माइक्रोइलेक्ट्रॉनिक के लिए विकसित प्रौद्योगिकियों से उत्पन्न माइक्रोफ्लुइडिक्स के क्षेत्र कोजैविक विज्ञान द्वारा अपनाया गया है। माइक्रोफ्लुइडिक प्रौद्योगिकियां लघु चैनलों के बेस्पोक नेटवर्क के भीतर तरल पदार्थों की छोटी मात्रा को विनियमित करती हैं, जिसमें माइक्रोमीटर पैमाने पर कम से कम एक आयाम होता है, और जैविक अनुसंधान में उनका उपयोग20 का विस्तार हो रहा है। विशेष रूप से, फिलामेंटस कवक 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 की वृद्धि की जांच करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण विकसित किए गए हैं। इस तकनीक का उपयोग करने का एक लाभ यह है कि हाइप का कारावास और माइक्रोचैनलों के भीतर पोषक तत्वों का वितरण पारंपरिक अगर विधियों की तुलना में मिट्टी के वातावरण की संरचना से अधिक निकटता से मिलता जुलताहै 31. हाल ही में, माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफार्मों का उपयोग मानव न्यूट्रोफिल और फंगल रोगजनकों32, बैक्टीरिया और पौधों की जड़ों33, साथ ही कवक और नेमाटोड34,35 के बीच बातचीत की जांच करने के लिए किया गया है।
माइक्रोबियल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक्स का उपयोग करने के कई फायदों में से एक में माइक्रोचैनल पर्यावरण का विशिष्ट नियंत्रण शामिल है। उदाहरण के लिए, लामिना प्रवाह शासनों को परिभाषित एकाग्रता ढाल उत्पन्न करने के लिए शोषण किया जा सकता है, जो बैक्टीरिया केमोटैक्सिस36 की जांच करते समय विशेष रूप से उपयोगी होता है। एक अन्य लाभ यह है कि पॉली (डाइमिथाइलसिलोक्सेन) (पीडीएमएस) की पारदर्शी प्रकृति, एक सस्ती, जैव संगत इलास्टोमेरिक बहुलक आमतौर पर माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के निर्माण में उपयोग किया जाता है, ब्राइटफील्ड और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी37 का उपयोग करके एकल कोशिकाओं के उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग की सुविधा प्रदान करता है। इसी तरह, माइक्रोचैनलों के भीतर रोगाणुओं के कारावास का मतलब है कि एकल कोशिकाओं पर नज़र रखने वाले समय-चूक प्रयोग किए जा सकते हैं, जिससे व्यक्तिगत सेलुलर प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड किया जा सकता है और37 की मात्रा निर्धारित की जा सकती है। अंत में, जैसा कि माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को उपयोगकर्ता के अनुकूल होने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है, उन्हें गैर-विशेषज्ञों द्वारा आसानी से नियोजित किया जा सकताहै।
जैव विविधता को बनाए रखने और स्थलीय वातावरण पर जलवायु परिवर्तन के प्रभाव को कम करने के लिए टिकाऊ पारिस्थितिकी तंत्र प्रबंधन प्रथाओं में सुधार के लिए मिट्टी में रहने वाले सूक्ष्मजीवों के बीच बातचीत के ज्ञान कोआगे बढ़ाना महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, उपन्यास माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का विकास कवक की समझ और सेलुलर स्तर पर उनकी बातचीत का विस्तार करने के लिए मौलिक है। यहां प्रोटोकॉल बीएफआई40 और एफएफआई41 के अध्ययन के लिए उत्पादित दो माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों पर ध्यान केंद्रित करेगा जैसा कि चित्र 1 में दर्शाया गया है।
चित्रा 1: बैक्टीरियल-फंगल इंटरैक्शन (बीएफआई) और फंगल-फंगल इंटरैक्शन (एफएफआई) उपकरणों का दृश्य और योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। डिवाइस में हाइफल वृद्धि की अनुमति देने के लिए माइक्रोचैनल के एक छोर के प्रवेश द्वार पर एक माइसेलियल प्लग रखा गया है। जीवाणु इनलेट विपरीत छोर पर है। स्केल बार = 5 मिमी (बी) बीएफआई डिवाइस का योजनाबद्ध अवलोकन, बैक्टीरिया इनलेट्स की स्थिति और इंटरैक्शन माइक्रोचैनल के माध्यम से हाइफल विकास की दिशा को दर्शाता है। चैनल गहराई में 10 μm, 100 μm चौड़ा और 7 मिमी लंबा है, जिसमें कुल 28 अवलोकन चैनल हैं। (सी) कोप्रिनोप्सिस सिनेरिया और बेसिलस सबटिलिस एनसीआईबी 3610 के बीच अगर प्लेट पर टकराव परख, स्केल बार = 20 मिमी (बाएं)। माइक्रोचैनल (मध्य और दाएं) के भीतर सी सिनेरिया और बी सबटिलिस एनसीआईबी 3610 के बीच बातचीत दिखाने वाली माइक्रोस्कोपी छवियां, यानी, फंगल हाइपहे के लिए बैक्टीरिया का ध्रुवीय लगाव। स्केल बार = 25 μm (मध्य) और 10 μm (दाएं)। (डी) एफएफआई डिवाइस की छवि एक ग्लास-तल वाले पेट्री डिश से बंधी हुई है, जो मायसेलियल प्लग के साथ दोहरी टीका है। स्केल बार = 1 सेमी (ई) एफएफआई डिवाइस का योजनाबद्ध अवलोकन। डिवाइस के दोनों छोर पर इनलेट में दो फंगल इनोकुलेंट प्लग पेश किए जाते हैं, जिससे माइक्रोचैनलों के हाइफल अन्वेषण की अनुमति मिलती है। नियंत्रण चैनल केवल एक फंगल इनलेट से जुड़े होते हैं और परीक्षण कवक के बीच बातचीत को रोकने, एक मृत अंत चैनल होता है। इंटरैक्शन चैनल दोनों फंगल इनलेट्स को जोड़ते हैं और माइक्रोचैनल के भीतर परीक्षण विषयों के बीच हाइफल इंटरैक्शन की अनुमति देते हैं। प्रत्येक इंटरैक्शन चैनल में 18 हीरे के आकार के खंड होते हैं, जो 8.8 मिमी (490 x 430 μm प्रति हीरा), 10 μm गहरे, और 20 μm के प्रत्येक हीरे के बीच एक कनेक्टिंग क्षेत्र की कुल लंबाई को मापते हैं। चैनल प्रकार डुप्लिकेट किए जाते हैं, स्केल बार = 1 मिमी (एफ) दो आने वाले हाइफल मोर्चों के बीच इंटरैक्शन ज़ोन, इंटरकनेक्टेड इंटरैक्शन चैनल के विपरीत सिरों से बढ़ता है। चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी छवि, स्केल बार = 250 μm। इस आंकड़े में पैनलों को स्टेनली एट अल, 2014 (ए-सी) 40 और गिमेनो एट अल, 2021 (डी-एफ) 41 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
यह लेख चैनल माइक्रोफ्लुइडिक्स का उपयोग करके फंगल-माइक्रोबियल इंटरैक्शन के अध्ययन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। लेखकों का उद्देश्य इन उपकरणों की बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन करना और शोधकर्ता…
The authors have nothing to disclose.
हम इंपीरियल कॉलेज लंदन और लीवरहुल्मे ट्रस्ट (रिसर्च ग्रांट रेफरेंस: आरपीजी -2020-352) में बायोइंजीनियरिंग विभाग से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं।
Agar | Difco Laboratories | 214010 | Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes |
Aluminum foil | Fisher Scientific Ltd | 11759408 | |
AutoCAD 2021 | Autodesk, USA | ||
Autoclave (VX-75) | Systec | ||
Centrifuge (5810R) | Eppendorf | ||
Chlorotrimethysilane | Merck Life Sciences | 386529 | CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area. |
Cork borer | SLS | COR1000 | |
Developer solution (mr-Dev 600) | Microresist Technologies | CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable | |
Erlenmeyer flasks | VWR | 214-1108 | e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs |
Ethanol (70% v/v) | Fisher Scientific Ltd | E/0650DF/15 | Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade) |
Fiji | ImageJ | Exemplar software package for imaging processing | |
Filtered, compressed air | Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used. | ||
Flat-headed wafer tweezers | SLS | INS5026 | |
Forceps | Fisher Scientific Ltd | 10008051 | Bent, sharp |
Glass bottom petri dish | World Precision Instruments | FD35-100 | 35 mm |
Glass bottom petri dish | World Precision Instruments | FD5040-100 | 50 mm |
Glass crystallisation dishes | VWR | 216-1865 | Used for washing of PDMS slabs |
Glass crystallisation dishes | VWR | 216-1866 | Used in the development of master moulds |
Glass media bottles | Fisher Scientific Ltd | 15456113 | e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs |
Glass syringe (Hamilton) | Fisher Scientific Ltd | 10625251 | Used for dispensing chlorotrimethylsilane |
Hot plate (HP 160 III BM) | SAWATEC | ||
Inoculation loop | VWR | COPA175CS01 | |
Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
Laminar flow hood | Air Science (PCR) | Exemplar laminar flow hood used for device fabrication | |
LB medium | Fisher Scientific Ltd | BP9723-500 | Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture |
Light emitting diode light engine (LedHUB) | Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH | Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence) | |
MA6 Ultraviolet mask aligner | Suss Microtec | ||
Malt extract | VWR | 84618 | Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar) |
Mask Writer | Applied Materials | 4700DP | Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography |
Master mould plastic mount | 3D-printed bespoke holder manufactured in-house | ||
Microbiological safety cabinet (BioMat2) | Contained Air Solutions | Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation | |
Milli-Q purified water | Available as standard in biology labs. | ||
NaOH | Fisher Scientific Ltd | BP359-500 | |
NIS-Elements Advanced Research imaging software | Nikon | Exemplar software package for image acquisition | |
NIS-Elements Free Viewer | Nikon | Exemplar software package for viewing acquired images | |
Oven (Binder BD115) | Fisher Scientific Ltd | 15602126 | Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS) |
Oven (CLO-2AH-S) | KOYO | Used for preparing silicon wafers | |
Parafilm | Bemis | HS234526B | transparent film |
Petri dishes, square sterile | Fisher Scientific Ltd | 11708573 | 120.5 mm |
Petri dishes, sterile | Fisher Scientific Ltd | 15370366 | 90 mm |
Photolithography mask | Micro Lithography Services Ltd. UK | ||
Plasma cleaner (Zepto) | Diener Electronic | 100012601 | |
Plastic cup | Semadeni | 8323 | |
Plastic spatula | Semadeni | 3340 | |
Portable precision balance (OHAUS Scout) | Fisher Scientific Ltd | 15519631 | Used for weighing PDMS, media components etc. |
Precision cutter | Syneo | HS1251135P1183 | Cutting edge diameter: 3.18 mm |
Precision cutter | Syneo | HS1871730P1183S | Cutting edge diameter: 4.75 mm |
Profilometer | Bruker | Dektak XT-stylus | |
Razor blades | Häberle Labortechnik | 9156110 | |
Refridgerator | Haden | 4-6 °C | |
Retiga R1 CCD camera | Qimaging | Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions | |
Scotch magic tape | Office Depot | 3969954 | 19 mm invisible tape; clear tape |
Shaking incubator (Cole-Parmer SI500) | Fisher Scientific Ltd | 10257954 | |
Silicon wafer | Inseto | 100 mm | |
Soda lime glass plate | Inseto | 125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Spincoater | SAWATEC | SM-180-BM | |
SU-8 2010 photoresist | MicroChem | CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment. | |
Sylgard 184 elastomer kit | VWR | 634165S | Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices |
Temperature controlled incubator | Okolab | Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions | |
Ti2-E inverted epifluorescence microscope | Nikon | MEA54000 | Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions |
Ultrasonic cleaner S-Line | Fisher Scientific Ltd | FB15050 | |
Vacuum desiccator | Fisher Scientific Ltd | 10528861 | Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators |
x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens | Nikon | MRH20105 | Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions |
x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens | Nikon | MRH48230 | Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions |