Mikrofluidiske verktøy for probing av sopp-mikrobielle interaksjoner på cellenivå

Summary

På grunn av jordens opasitet kan interaksjoner mellom dens bestanddeler ikke lett visualiseres med cellulær oppløsning. Her presenteres to mikrofluidiske verktøy, som gir nye muligheter for å undersøke sopp-mikrobielle interaksjoner. Enhetene er allsidige og enkle å bruke, noe som muliggjør høy romlig kontroll og høyoppløselig bildebehandling på mobilnivå.

Abstract

Filamentøse sopp er vellykkede innbyggere i jord og spiller en viktig rolle i jordøkosystemer, som i nedbrytning av organisk og uorganisk materiale, samt regulering av næringsnivåer. Der finner de også mange muligheter til å samhandle med en rekke andre mikrober som bakterier eller andre sopp. Å studere soppinteraksjoner på cellenivå kan imidlertid være utfordrende på grunn av jordens svarte bokslignende natur. Nye mikrofluidiske verktøy utvikles for studiet av soppinteraksjoner; to plattformer designet for å studere bakteriell-sopp og sopp-sopp interaksjoner er fremhevet. Innenfor disse mikrokanalene kan sopp-mikrobielle interaksjoner overvåkes i kontrollerte fysisk-kjemiske miljøer med høyere temporal og romlig oppløsning enn tidligere mulig. Anvendelsen av disse verktøyene har gitt en rekke nye biologiske innsikter, for eksempel observasjon av bakteriell polar tilknytning til hyphae eller avsløre ukarakteriserte sopp-sopp antagonismer. Et sentralt trekk ved disse metodene anser brukervennligheten av dette verktøyet av ikke-eksperter, noe som gir svært overførbare teknologier for bruk i mikrobiologilaboratorier.

Introduction

Jord er et eksepsjonelt mangfoldig miljø som inneholder en overflod av mikroorganismer som er medvirkende til karbon- og fosforsykluser ^1,2. Filamentøse sopp er en viktig komponent i mange økosystemer som nedbrytere av organisk og uorganisk materiale og kan forbedre ernæringen av planter gjennom dannelsen av symbiotiske forhold ^3,4. Innenfor jord samhandler sopp dynamisk med en rekke mikrober som andre sopp⁵, bakterier⁶, virus⁷ og nematoder⁸. Disse interaksjonene har betydelige konsekvenser for jord- og plantehelsen. Likevel, på grunn av mangel på passende eksperimentelle systemer som er i stand til å avbilde interagerende mikroorganismer med høy oppløsning, forblir mange udefinerte.

Undersøkelser om bakteriell-sopp interaksjoner (BFF) og sopp-sopp interaksjoner (FFIer) har verdifulle anvendelser på en rekke felt, inkludert antimikrobielle midler i medisin og biologiske kontrollmidler i landbruket. For eksempel produserer sopp coprinopsis cinerea peptid copsin, som har vist seg å vise antibakteriell aktivitet mot det menneskelige patogenet Listeria monocytogenes⁹. På samme måte er den soppavledede forbindelsen, griseofulvin, mye brukt som behandling for menneskelige soppinfeksjoner og er i tillegg i stand til å hemme veksten av planten patogen sopp Alternaria solani^10,11. Flere stammer av jordboende bakterie Bacillus subtilis har også vist seg å være effektive biokontrollmidler av soppplantepatogenet Rhizoctonia solani^12,13. Likevel, på grunn av begrensninger knyttet til tradisjonelle metoder, er BBFIer og FFIer dårlig forstått på nivået av enkeltceller.

Konvensjonelle studier utforsker vanligvis BBFIer og FFIer på makroskalaen ved hjelp av agarplater med to eller flere arter i konfrontasjon. Deres interaksjon vurderes ved å måle vekstrater og metabolittproduksjon av de konfronterende artene 14,15,16; Denne metodikken løses imidlertid bare til koloninivå. For å studere interaksjoner på cellenivå, kan bakterielle og soppinokulanter dyrkes på glassmikroskopsklier belagt med agar som deretter avbildes under et mikroskop¹⁷. Likevel kan det være vanskelig å følge en enkelt hypha ved hjelp av mikroskoplysbilder på grunn av mangel på innesperring, noe som betyr at tidsforløpbilder er vanskeligere å få tak i. Videre er muligheten til å romlig begrense andre mikroorganismer innenfor definerte regioner i soppmiceliet eller skape definerte kjemiske miljøer som for eksempel kan bli forstyrret, ikke mulig i slike oppsett. Jordens “black box” natur legger også til kompleksiteten ved å studere sopp-mikrobielle interaksjoner på nivået av enkeltceller¹⁸. Ved å observere interagerende arter vekk fra det utrolige mangfoldet i jordmikrobiomet, kan den nøyaktige måten individuelle medlemmer samhandler på vurderes. Dermed er det et fortsatt behov for allsidige plattformer som muliggjør høyoppløselig, encellet bildebehandling av BFFIer og FFIer.

Mikrofluidisk teknologi, såkalte lab-on-a-chip-systemer, gir en ideell plattform for studiet av BFF-er og FFIer på nivået av enkeltceller. Feltet mikrofluidikk, med opprinnelse fra teknologier utviklet for kjemisk analyse og mikroelektronikk, er vedtatt av biovitenskapene¹⁹. Mikrofluidiske teknologier regulerer små mengder væsker i et skreddersydd nettverk av miniatyriserte kanaler, har minst en dimensjon på mikrometreskalaen, og bruken i biologisk forskning utvides²⁰. Spesielt er mikrofluidiske enheter utviklet for å undersøke veksten av filamentøse sopp 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30. En fordel med å bruke denne teknologien er at innesperring av hyphae og fordelingen av næringsstoffer i mikrokanal ligner mer på jordens struktur enn konvensjonelle agarmetoder³¹. Nylig har mikrofluidiske plattformer blitt brukt til å undersøke interaksjoner mellom menneskelige nøytrofiler og sopppatogener³², bakterier og planterøtter³³, samt sopp og nematoder^34,35.

En av de mange fordelene ved å bruke mikrofluidikk for å studere mikrobielle interaksjoner inkluderer den spesifikke kontrollen av mikrokanalmiljøet. For eksempel kan laminære strømningsregimer utnyttes for å generere definerte konsentrasjonsgradienter, noe som er spesielt nyttig når du undersøker bakteriell chemotaxis³⁶. En annen fordel er at den gjennomsiktige naturen til poly (dimetylsiloksan) (PDMS), en billig, biokompatibel elastomerisk polymer som vanligvis brukes til fremstilling av mikrofluidiske enheter, letter høyoppløselig avbildning av enkeltceller ved hjelp av brightfield og fluorescensmikroskopi³⁷. På samme måte betyr innesperring av mikrober i mikrokanal at tidsforløpeksperimenter som sporer enkeltceller, kan utføres, slik at individuelle cellulære responser kan registreres og kvantifiseres³⁷. Til slutt, da mikrofluidiske enheter kan utformes for å være brukervennlige, kan de enkelt brukes av ikke-eksperter³⁸.

Videre kunnskap om samspillet mellom jordboende mikroorganismer er viktig for å forbedre bærekraftige økosystemforvaltningspraksiser som opprettholder biologisk mangfold og for å redusere virkningen av klimaendringer på terrestriske miljøer³⁹. Dermed er utviklingen av nye mikrofluidiske verktøy grunnleggende for å utvide forståelsen av sopp og deres interaksjoner på cellenivå. Protokollen her vil fokusere på to mikrofluidiske enheter produsert for studiet av BFIer⁴⁰ og FFIer⁴¹ som representert i figur 1.

Figur 1: Visuell og skjematisk fremstilling av bakteriell soppinteraksjon (BFI) og sopp-soppinteraksjonsenheter (FFI). (A) Bilde av BFI-enheten. En mycelial plugg er plassert ved inngangen til den ene enden av mikrokanalene for å tillate hyphalvekst i enheten. Bakterieinntaket er i motsatt ende. Skalastang = 5 mm. (B) Skjematisk oversikt over BFI-enheten, som viser plasseringen av bakterieinntakene og retningen av hyphalvekst gjennom interaksjonsmikrokanalene. Kanalene er 10 μm i dybden, 100 μm brede og 7 mm lange, med totalt 28 observasjonskanaler. (C) Konfrontasjonsanalyse på agarplate mellom Coprinopsis sinerea og Bacillus subtilis NCIB 3610, skala bar = 20 mm (venstre). Mikroskopibilder som viser samspillet mellom C. cinerea og B. subtilis NCIB 3610 innenfor mikrokanal (midten og høyre), det vil si polar festing av bakterier til sopphyphae. Skalastang = 25 μm (midten) og 10 μm (høyre). (D) Bilde av FFI-enheten festet til en glassbunnet Petri-tallerken, dobbelt inokulert med mycelialplugger. Skalastang = 1 cm. (E) Skjematisk oversikt over FFI-enheten. To soppinokulantplugger blir introdusert i innløpene i hver ende av enheten, slik at hyphalutforskning av mikrokanalene tillater hyphalutforskning av mikrokanalene. Kontrollkanaler er kun koblet til ett soppinntak og har en blind kanal, noe som forhindrer interaksjoner mellom testsvampene. Interaksjonskanaler forbinder både soppinntak og tillater hyphalinteraksjoner mellom testpersonene i mikrokanal. Hver interaksjonskanal består av 18 diamantformede seksjoner, som måler en total lengde på 8,8 mm (490 x 430 μm per diamant), 10 μm dyp og har en forbindelsesregion mellom hver diamant på 20 μm. Kanaltyper dupliseres, skalastenger = 1 mm. (F) Interaksjonssone mellom to nærliggende hyphalfronter, som vokser fra motsatte ender av den sammenkoblede samhandlingskanalen. Fasekontrastmikroskopibilde, skalalinje = 250 μm. Panelene i denne figuren er modifisert fra Stanley et al., 2014 (A-C)⁴⁰ og Gimeno et al., 2021 (D-F)⁴¹. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

MERK: Et sammendrag av prosedyrene som er beskrevet i denne protokollen, er visuelt avbildet i figur 2. Figur 2: Skjematisk fremstilling av den presenterte metodikken bestående av fem hoveddeler som er beskrevet i denne protokollen. Enhetsdesign er laget ved hjelp av CAD-programvare (Compute…

Representative Results

Representative resultater presenteres fra de eksemplariske BFI40- og FFI41-enhetene. Hyphal vekstratemålinger kan enkelt oppnås ved hjelp av disse enhetene i kombinasjon med grunnleggende mikroskopiteknikker. Figur 3A-B illustrerer bakteriell-sopp interaksjoner mellom C. cinerea hyphae og B. subtilis NCIB 3610. Tilstedeværelsen av B. subtilis stopper veksten av C. cinerea …

Discussion

Denne artikkelen presenterer en protokoll for studiet av sopp-mikrobielle interaksjoner ved hjelp av kanalmikrofluidikk. Forfatterne tar sikte på å demonstrere allsidigheten til disse enhetene og oppmuntre til tilpasning som passer forskerens interesser. Ved hjelp av de eksemplariske BFI- og FFI-enhetene kan soppmikrobielle interaksjoner studeres mer detaljert enn tidligere tilgjengelig. Ved å fjerne jordens bakgrunnskompleksitet og heterogenitet, moderere veksten av hyphae slik at de er begrenset til en enkelt monola…

Materials

Agar	Difco Laboratories	214010	Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes
Aluminum foil	Fisher Scientific Ltd	11759408
AutoCAD 2021	Autodesk, USA
Autoclave (VX-75)	Systec
Centrifuge (5810R)	Eppendorf
Chlorotrimethysilane	Merck Life Sciences	386529	CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area.
Cork borer	SLS	COR1000
Developer solution (mr-Dev 600)	Microresist Technologies		CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable
Erlenmeyer flasks	VWR	214-1108	e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs
Ethanol (70% v/v)	Fisher Scientific Ltd	E/0650DF/15	Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade)
Fiji	ImageJ		Exemplar software package for imaging processing
Filtered, compressed air			Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used.
Flat-headed wafer tweezers	SLS	INS5026
Forceps	Fisher Scientific Ltd	10008051	Bent, sharp
Glass bottom petri dish	World Precision Instruments	FD35-100	35 mm
Glass bottom petri dish	World Precision Instruments	FD5040-100	50 mm
Glass crystallisation dishes	VWR	216-1865	Used for washing of PDMS slabs
Glass crystallisation dishes	VWR	216-1866	Used in the development of master moulds
Glass media bottles	Fisher Scientific Ltd	15456113	e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs
Glass syringe (Hamilton)	Fisher Scientific Ltd	10625251	Used for dispensing chlorotrimethylsilane
Hot plate (HP 160 III BM)	SAWATEC
Inoculation loop	VWR	COPA175CS01
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	W292907
Laminar flow hood	Air Science (PCR)		Exemplar laminar flow hood used for device fabrication
LB medium	Fisher Scientific Ltd	BP9723-500	Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture
Light emitting diode light engine (LedHUB)	Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH		Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence)
MA6 Ultraviolet mask aligner	Suss Microtec
Malt extract	VWR	84618	Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar)
Mask Writer	Applied Materials	4700DP	Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography
Master mould plastic mount			3D-printed bespoke holder manufactured in-house
Microbiological safety cabinet  (BioMat2)	Contained Air Solutions		Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation
Milli-Q purified water			Available as standard in biology labs.
NaOH	Fisher Scientific Ltd	BP359-500
NIS-Elements Advanced Research imaging software	Nikon		Exemplar software package for image acquisition
NIS-Elements Free Viewer	Nikon		Exemplar software package for viewing acquired images
Oven (Binder BD115)	Fisher Scientific Ltd	15602126	Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS)
Oven (CLO-2AH-S)	KOYO		Used for preparing silicon wafers
Parafilm	Bemis	HS234526B	transparent film
Petri dishes, square sterile	Fisher Scientific Ltd	11708573	120.5 mm
Petri dishes, sterile	Fisher Scientific Ltd	15370366	90 mm
Photolithography mask	Micro Lithography Services Ltd. UK
Plasma cleaner (Zepto)	Diener Electronic	100012601
Plastic cup	Semadeni	8323
Plastic spatula	Semadeni	3340
Portable precision balance (OHAUS Scout)	Fisher Scientific Ltd	15519631	Used for weighing PDMS, media components etc.
Precision cutter	Syneo	HS1251135P1183	Cutting edge diameter: 3.18 mm
Precision cutter	Syneo	HS1871730P1183S	Cutting edge diameter: 4.75 mm
Profilometer	Bruker		Dektak XT-stylus
Razor blades	Häberle Labortechnik	9156110
Refridgerator	Haden		4-6 °C
Retiga R1 CCD camera	Qimaging		Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Scotch magic tape	Office Depot	3969954	19 mm invisible tape; clear tape
Shaking incubator (Cole-Parmer SI500)	Fisher Scientific Ltd	10257954
Silicon wafer	Inseto		100 mm
Soda lime glass plate	Inseto		125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Spincoater	SAWATEC	SM-180-BM
SU-8 2010 photoresist	MicroChem		CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment.
Sylgard 184 elastomer kit	VWR	634165S	Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices
Temperature controlled incubator	Okolab		Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Ti2-E inverted epifluorescence microscope	Nikon	MEA54000	Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Ultrasonic cleaner S-Line	Fisher Scientific Ltd	FB15050
Vacuum desiccator	Fisher Scientific Ltd	10528861	Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators
x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens	Nikon	MRH20105	Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions
x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens	Nikon	MRH48230	Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions