टेंसोमेट्रिक स्मॉल वॉल्यूम चैंबर मायोग्राफ़ी का उपयोग करके माउस थोरैसिक महाधमनी में एंडोथेलियम-निर्भर वैसोरलैक्सेशन का माप
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल माउस महाधमनी एंडोथेलियल फ़ंक्शन के प्रयोगात्मक पूर्व विवो मूल्यांकन में एक बहु-कक्ष मायोग्राफ प्रणाली का उपयोग करके टेंसोमेट्रिक मायोग्राफ तकनीक की अवधारणाओं और तकनीकी अनुप्रयोग का वर्णन करता है।
Abstract
छोटी मात्रा कक्ष टेन्सोमेट्रिक मायोग्राफी प्रयोगशाला जानवरों और मानव ऊतक से अलग छोटी धमनियों में छोटे और बड़े रक्त वाहिकाओं की संवहनी सिकुड़न का मूल्यांकन करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक है। तकनीक शोधकर्ताओं को विभिन्न पर्यावरणीय कारकों को समायोजित करने के विकल्प के साथ, विभिन्न पर्यावरणीय कारकों को समायोजित करने के विकल्प के साथ, अलग-अलग रक्त वाहिकाओं को कसकर नियंत्रित और मानकीकृत (निकट-शारीरिक) सेटिंग में बनाए रखने की अनुमति देती है, जबकि अलग-अलग औषधीय एजेंटों के साथ अलग-थलग वाहिकाओं को चुनौती देती है जो वाहिकासंकीर्णन या वासोडिलेशन को प्रेरित कर सकती हैं। मायोग्राफ चैंबर विभिन्न हार्मोन, अवरोधकों और एगोनिस्ट के जवाब में संवहनी प्रतिक्रिया को मापने के लिए एक मंच भी प्रदान करता है जो चिकनी मांसपेशियों और एंडोथेलियल परतों के कार्य को अलग-अलग या एक साथ प्रभावित कर सकता है। रक्त वाहिका की दीवार एक जटिल संरचना है जिसमें तीन अलग-अलग परतें होती हैं: इंटिमा (एंडोथेलियल परत), मीडिया (चिकनी मांसपेशी और इलास्टिन फाइबर), और एडवेंटिटिया (कोलेजन और अन्य संयोजी ऊतक)। प्रत्येक परत के कार्यात्मक गुणों की स्पष्ट समझ हासिल करने के लिए, एक प्रयोगात्मक मंच और प्रणाली तक पहुंच होना महत्वपूर्ण है जो एक साथ सभी तीन परतों का अध्ययन करने के लिए एक संयोजन दृष्टिकोण की अनुमति देगा। इस तरह का दृष्टिकोण एक अर्ध-शारीरिक स्थिति तक पहुंच की मांग करता है जो एक पूर्व विवो सेटिंग में विवो वातावरण की नकल करेगा। छोटे वॉल्यूम चैंबर टेंसोमेट्रिक मायोग्राफी ने संवहनी गुणों पर पर्यावरणीय संकेतों, प्रयोगात्मक चर, या फार्माकोलॉजिकल एगोनिस्ट और विरोधी के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक आदर्श वातावरण प्रदान किया है। कई वर्षों से, वैज्ञानिकों ने विभिन्न एजेंटों के जवाब में एंडोथेलियल फ़ंक्शन और चिकनी मांसपेशियों की सिकुड़न को मापने के लिए टेंसोमेट्रिक मायोग्राफ तकनीक का उपयोग किया है। इस रिपोर्ट में, पृथक माउस महाधमनी में एंडोथेलियल फ़ंक्शन को मापने के लिए एक छोटे वॉल्यूम चैंबर टेंसोमेट्रिक मायोग्राफ सिस्टम का उपयोग किया जाता है। यह रिपोर्ट इस बात पर केंद्रित है कि थोरैसिक महाधमनी जैसे बड़े धमनी के छोटे खंडों में एंडोथेलियम की कार्यात्मक अखंडता का मूल्यांकन करने के लिए छोटे वॉल्यूम चैंबर टेंसोमेट्रिक मायोग्राफी का उपयोग कैसे किया जा सकता है।
Introduction
पिछले कुछ दशकों से, छोटे कक्ष मायोग्राफ़ी सिस्टम का उपयोग एक पूर्व विवो, वास्तविक समय सेटिंग में विभिन्न औषधीय एजेंटों और न्यूरोट्रांसमीटर के जवाब में रक्त वाहिका की दीवारों की विभिन्न परतों की प्रतिक्रिया को मापने के लिए किया गया है। संवहनी प्रतिक्रिया एक स्वस्थ कार्यात्मक रक्त वाहिका का एक प्रमुख घटक है और परिधीय और सेरेब्रल वास्कुलचर1 में रक्त प्रवाह और छिड़काव के नियमन के लिए महत्वपूर्ण है। रक्त वाहिका की दीवार के भीतर, एंडोथेलियल और चिकनी मांसपेशियों की परतों के बीच बातचीत संवहनी टोन का एक प्रमुख निर्धारक है, जो रक्त वाहिका की दीवार (एडवेंटिटिया) के आसपास संयोजी ऊतक परत में संरचनात्मक परिवर्तनों से भी लगातार प्रभावित होती है।
एंडोथेलियल परत नाइट्रिक ऑक्साइड (एनओ), प्रोस्टासाइक्लिन (पीजीआई 2), और एंडोथेलियम-व्युत्पन्न हाइपरपोलराइज़िंग फैक्टर (ईडीएचएफ) सहित कुछ वासोडिलेटरी कारकों को जारी करके या एंडोथेलिन -1 (ईटी -1) और थ्रोम्बोक्सेन (टीएक्सए 2) 2,3,4 जैसे वासोकॉन्स्ट्रिक्टिव एजेंटों का उत्पादन करके वासोमोशन को नियंत्रित करती है। इन कारकों में से, एनओ का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, और सूजन, प्रवासन, अस्तित्व और प्रसार जैसे अन्य महत्वपूर्ण सेलुलर कार्यों में इसकी महत्वपूर्ण नियामक भूमिकाओं को वैज्ञानिक साहित्य 2,5 में अत्यधिक उद्धृत किया गया है।
संवहनी जीव विज्ञान के क्षेत्र में, चैंबर मायोग्राफी ने संवहनी फिजियोलॉजिस्ट और फार्माकोलॉजिस्ट को कसकर नियंत्रित अर्ध-शारीरिक प्रणाली1 में एंडोथेलियल फ़ंक्शन को मापने के लिए एक मूल्यवान और विश्वसनीय उपकरण प्रदान किया है। वर्तमान में, वैज्ञानिकों के लिए दो अलग-अलग मायोग्राफ सिस्टम उपलब्ध हैं: वायर (या पिन) टेंसोमेट्रिक (आइसोमेट्रिक) मायोग्राफी और प्रेशर मायोग्राफी। एक तार मायोग्राफी प्रणाली में, रक्त वाहिका को दो तारों या पिनों के बीच फैलाया जाता है, जिससे रक्त वाहिका की दीवार में बल या तनाव विकास के आइसोमेट्रिक माप की अनुमति मिलती है, जबकि दबाव मायोग्राफी छोटी प्रतिरोध धमनियों में संवहनी प्रतिक्रिया के माप के लिए एक बेहतर मंच है, जहां रक्तचाप में परिवर्तन को संवहनी टोन और वासोमोशन में परिवर्तन के लिए मुख्य उत्तेजना माना जाता है। एक सामान्य सहमति है कि, मेसेंटेरिक और सेरेब्रल धमनियों जैसे छोटे प्रतिरोध धमनियों के लिए, दबाव मायोग्राफी एक ऐसी स्थिति बनाती है जो मानव शरीर में शारीरिक स्थितियों के करीब है। छोटे कक्ष मायोग्राफ का उपयोग महाधमनी जैसे बहुत बड़े जहाजों के लिए बहुत छोटे व्यास (200-500 μm) वाले जहाजों के लिए किया जा सकता है।
जबकि तार मायोग्राफ आइसोमेट्रिक स्थितियों के तहत रक्त वाहिका तनाव को रिकॉर्ड करने के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली है, दबाव मायोग्राफ आइसोबेरिक स्थितियों में परिवर्तन के जवाब में पोत व्यास में परिवर्तन को मापने के लिए एक अधिक उपयुक्त प्रणाली है। दबाव या प्रवाह में परिवर्तन के जवाब में पोत में व्यास परिवर्तन महाधमनी जैसी बड़ी लोचदार धमनियों की तुलना में एक छोटी मांसपेशियों की धमनी (धमनी) में बहुत बड़ा होता है। इन कारणों से, दबाव मायोग्राफ को पर्याप्त वैसोरेएक्टिविटी1 के साथ छोटी रक्त वाहिकाओं के लिए एक बेहतर उपकरण माना जाता है। बहु-कक्ष छोटे आयतन कक्ष टेंसोमेट्रिक मायोग्राफी की अन्य व्यावहारिक शक्तियों में से एक यह है कि परिवर्तनशीलता को कम करने और मजबूत और निर्णायक डेटा का उत्पादन करने के लिए एक ही धमनी के कई (चार तक) खंडों का अध्ययन करके संवहनी प्रतिक्रिया के लिए विभिन्न तंत्रों के योगदान को समझ सकते हैं। तकनीकी रूप से स्थापित करना और बनाए रखना भी अपेक्षाकृत आसान है। लगभग किसी भी आकार के जहाजों का अध्ययन तार मायोग्राफ के साथ किया जा सकता है। यह संवहनी कार्य का आकलन करने के लिए एक अधिक लागत प्रभावी समाधान है और प्रयोगों में दबाव मायोग्राफी का एक अच्छा विकल्प है जहां विच्छेदित पोत की लंबाई दबाव मायोग्राफ प्रोटोकॉल के लिए बहुत कम है।
यह रिपोर्ट डीएमटी -620 मल्टी-चैंबर मायोग्राफ सिस्टम (डीएमटी-यूएसए) का उपयोग करके छोटे वॉल्यूम चैंबर टेंसोमेट्रिक मायोग्राफी तकनीक में माउंटिंग पिन का उपयोग करके पृथक माउस थोरैसिक महाधमनी रिंग में एंडोथेलियल फ़ंक्शन के आकलन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करती है। यह प्रोटोकॉल 25-35 ग्राम के बीच औसत वजन के साथ 6 महीने के पुरुष C57BL6 माउस का उपयोग करता है। सौभाग्य से, इस प्रोटोकॉल को विभिन्न जानवरों के प्रकारों और वजन पर लागू किया जा सकता है, पोत प्रकारों और व्यास की व्यापक श्रृंखला को देखते हुए जिसके लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
संवहनी जीव विज्ञान का क्षेत्र उन उपकरणों पर बहुत अधिक निर्भर करता है जो शोधकर्ताओं को रक्त वाहिका की दीवार की कार्यात्मक और संरचनात्मक अखंडता का आकलन करने में मदद करते हैं। यह रक्त वाहिकाओं की तीन परत…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (आर 15एचएल 145646) और मिडवेस्टर्न यूनिवर्सिटी कॉलेज ऑफ ग्रेजुएट स्टडीज से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Acetylcholine | SigmaAldrich | A6625-100G | |
| CaCl2 | SigmaAldrich | C4901-1KG | |
| Carbogen gas | Matheson | H103847 | |
| Dissecting scissors | FST | 91460-11 | |
| DMT 620 Multi chamber myograph system | DMT | DMT 620 | Multi chamber myograph system |
| Dumont forceps | FST | 91150-20 | |
| EDTA | SigmaAldrich | E5134-10G | |
| Glucose | SigmaAldrich | G8270-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H7006-1KG | |
| KCl | SigmaAldrich | P9541-1KG | |
| KH2PO4 | SigmaAldrich | P5655-1KG | |
| LabChart | ADI instruments | Data acquisition software | |
| Light source | Volpi | 14363 | |
| L-Name | Fischer Scientific | 50-200-7725 | |
| MgSO4 | SigmaAldrich | M2643-500G | |
| Microscope | Leica | S6D | stereo zoom microscope |
| NaCl | SigmaAldrich | S5886-5KG | |
| NaHCO3 | SigmaAldrich | S5761-500G | |
| Organ bath system | DMT | 720MO | |
| Phenylephrine | SigmaAldrich | P6126-10G | |
| Pump | Welch | 2546B-01 | |
| Software | ADI instruments | LabChart 8.1.20 | |
| Spring Scissors | FST | 15003-08 | |
| Sylgard 184 Kit | Electron Microscopy Services | 24236-10 | silicone elastomer kit |
| Tank Regulator | Fischer Scientific | 10575147 | |
| Water bath system | Fischer Scientific | 15-462-10 |
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