Preparazione del campione per l'analisi rapida dei lipidi nel cervello della Drosophila utilizzando la spettrometria di massa a desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice
Summary
Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire una guida dettagliata sulla corretta preparazione del campione per l’analisi dei lipidi e dei metaboliti in piccoli tessuti, come il cervello di Drosophila , utilizzando l’imaging con spettrometria di massa a desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI).
Abstract
Il profilo lipidico, o lipidomica, è una tecnica consolidata utilizzata per studiare l’intero contenuto lipidico di una cellula o di un tessuto. Le informazioni acquisite dalla lipidomica sono preziose per studiare i percorsi coinvolti nello sviluppo, nella malattia e nel metabolismo cellulare. Molti strumenti e strumentazioni hanno aiutato i progetti di lipidomica, in particolare varie combinazioni di spettrometria di massa e tecniche di cromatografia liquida. L’imaging con desorbimento/spettrometria di massa a ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI MSI) è recentemente emerso come una potente tecnica di imaging che integra gli approcci convenzionali. Questa nuova tecnica fornisce informazioni uniche sulla distribuzione spaziale dei lipidi all’interno dei compartimenti tissutali, che in precedenza era irraggiungibile senza l’uso di modifiche eccessive. La preparazione del campione dell’approccio MALDI MSI è fondamentale e, pertanto, è al centro di questo articolo. Questo articolo presenta un’analisi lipidica rapida di un gran numero di cervelli di Drosophila incorporati in composti a temperatura di taglio ottimale (OCT) per fornire un protocollo dettagliato per la preparazione di piccoli tessuti per l’analisi dei lipidi o dei metaboliti e delle piccole molecole attraverso MALDI MSI.
Introduction
I lipidi sono coinvolti in una vasta gamma di processi biologici e possono essere classificati in cinque categorie in base alla loro diversità strutturale: acidi grassi, triacilgliceroli (TAG), fosfolipidi, lipidi sterolici e sfingolipidi1. Le funzioni fondamentali dei lipidi sono quelle di fornire fonti di energia per i processi biologici (cioè i TAG) e formare le membrane cellulari (cioè fosfolipidi e colesterolo). Tuttavia, ulteriori ruoli dei lipidi sono stati notati nello sviluppo e nelle malattie e sono stati ampiamente studiati in campo biomedico. Ad esempio, i rapporti hanno dimostrato che gli acidi grassi di diverse lunghezze possono avere ruoli terapeutici unici. Le catene corte di acidi grassi possono essere coinvolte nei meccanismi di difesa contro le malattie autoimmuni, le catene di acidi grassi di media lunghezza producono metaboliti che possono mitigare le convulsioni e le lunghe catene di acidi grassi generano metaboliti che possono essere usati per trattare i disturbi metabolici2. Nel sistema nervoso, il colesterolo e i fosfolipidi derivati dalla glia hanno dimostrato di essere vitali per la sinaptogenesi 3,4. Altri tipi di lipidi hanno mostrato risultati promettenti nelle applicazioni mediche, compresi gli sfingolipidi utilizzati nei sistemi di somministrazione di farmaci e i saccarolipidi utilizzati per supportare il sistema immunitario 5,6. I numerosi ruoli e le potenziali applicazioni terapeutiche dei lipidi in campo biomedico hanno reso la lipidomica, lo studio delle vie e delle interazioni dei lipidi cellulari, un campo critico e sempre più importante.
La lipidomica fa uso della chimica analitica per studiare il lipidoma su larga scala. I principali metodi sperimentali utilizzati in lipidomica si basano sulla spettrometria di massa (MS) accoppiata con varie tecniche cromatografiche e di mobilità ionica 7,8. L’uso della SM nell’area è vantaggioso grazie alla sua elevata specificità e sensibilità, velocità di acquisizione e capacità uniche di (1) rilevare lipidi e metaboliti lipidici che si verificano anche a livelli bassi e transitori, (2) rilevare centinaia di diversi composti lipidici in un singolo esperimento, (3) identificare lipidi precedentemente sconosciuti e (4) distinguere tra isomeri lipidici. Tra gli sviluppi della SM, tra cui la ionizzazione elettrospray di desorbimento (DESI), MALDI e la spettrometria di massa a ioni secondari (SIMS), MALDI MSI è emersa come una potente tecnica di imaging che integra gli approcci convenzionali basati sulla SM fornendo informazioni uniche sulla distribuzione spaziale dei lipidi all’interno dei compartimenti tissutali 9,10.
Il flusso di lavoro tipico della lipidomica consiste nella preparazione del campione, nell’acquisizione dei dati mediante la tecnologia della spettrometria di massa e nell’analisi dei dati11. Lo studio dei lipidi e dei metaboliti nei campioni ha portato alla nascita di tecniche per comprendere le condizioni fisiologiche e patologiche dei processi metabolici negli organismi. Mentre la comprensione delle interazioni biologiche è importante, la sensibilità dei lipidi e dei metaboliti li rende difficili da visualizzare e identificare senza coloranti o altre modifiche. Cambiamenti nei livelli o nella distribuzione dei metaboliti possono portare a cambiamenti fenotipici. Uno strumento utilizzato per la profilazione metabolomica è MALDI MSI, una tecnica di imaging in situ senza etichetta in grado di rilevare centinaia di molecole contemporaneamente. L’imaging MALDI consente la visualizzazione di metaboliti e lipidi nei campioni preservandone l’integrità e la distribuzione spaziale. La tecnologia precedente per la profilazione dei lipidi prevedeva l’uso di sostanze chimiche radioattive per mappare individualmente i lipidi, mentre l’imaging MALDI rinuncia a questo e consente il rilevamento simultaneo di una gamma di lipidi.
Il metabolismo lipidico e l’omeostasi svolgono importanti funzioni nella fisiologia cellulare, come il mantenimento e lo sviluppo del sistema nervoso. Un aspetto essenziale del metabolismo lipidico del sistema nervoso è la spola lipidica tra neuroni e cellule gliali, che è mediata da lipoproteine trasportatrici molecolari, tra cui lipoproteine a bassissima densità (VLDL), lipoproteine a bassa densità (LDL) e lipoproteine ad alta densità (HDL)12. Le lipoproteine contengono apolipoproteine (Apo), come ApoB e ApoD, che funzionano come blocchi strutturali del carico lipidico e come ligandi per i recettori delle lipoproteine. La diafonia neurone-glia dei lipidi coinvolge molteplici attori come ApoD, ApoE e ApoJ derivati dalla glia e i loro recettori LDL neuronali (LDLR)13,14. In Drosophila, l’apolipopforina, un membro della famiglia ApoB, è un importante vettore lipidico emolinfatico15. L’apolipophorina ha due recettori della lipoforina strettamente correlati (LpR), LpR1 e LpR2, che sono omologhi delle LDLR15,16 dei mammiferi. In studi precedenti, la lipocalina secreta da astrociti Glial Lazarillo (GLaz), un omologo di Drosophila di ApoD umano, e il suo recettore neuronale LpR1 sono stati scoperti per mediare in modo cooperativo lo shuttling lipidico neurone-glia, regolando così la morfogenesi dei dendriti17. Pertanto, è stato ipotizzato che la perdita di LpR1 avrebbe causato una diminuzione del contenuto lipidico complessivo nel cervello di Drosophila. MALDI MSI sarebbe uno strumento adatto per profilare il contenuto lipidico in piccoli tessuti di cervelli di Drosophila mutante e wild-type LpR1−/−, come dimostrato in questo studio.
Nonostante la crescente popolarità di MALDI MSI, l’alto costo e la complessità sperimentale dello strumento spesso ne impediscono l’implementazione nei singoli laboratori. Pertanto, la maggior parte degli studi MALDI MSI sono condotti utilizzando strutture di base condivise. Come per altre applicazioni di MALDI MSI, un attento processo di preparazione dei campioni per la lipidomica è fondamentale per ottenere risultati affidabili. Tuttavia, poiché la preparazione del vetrino del campione viene tipicamente eseguita in singoli laboratori di ricerca, esiste la possibilità di variazioni nell’acquisizione di MALDI MSI. Per combattere questo, questo articolo mira a fornire un protocollo dettagliato per la preparazione del campione di piccoli campioni biologici prima della misurazione di MALDI MSI utilizzando l’analisi lipidica di un ampio gruppo di cervelli adulti di Drosophila in modalità ionica positiva come esempio11,17. Tuttavia, alcune classi di fosfolipidi e la maggior parte dei piccoli metaboliti sono favorevolmente rilevati dall’imaging MALDI in modalità ioni negativi, che è stata descritta in precedenza11. Pertanto, con questi due studi di esempio, speriamo di fornire protocolli dettagliati di preparazione del campione di varie combinazioni: tessuto grande indipendente contro tessuto piccolo incorporato, montaggio a disgelo contro montaggio a slitta calda e modalità ioni positivi contro modalità ioni negativi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Come dimostrato nello studio sulle variazioni nella composizione lipidica nei cervelli mutanti e wild-type di Drosophila, MALDI MSI può essere una preziosa tecnica di imaging label-free per l’analisi in situ dei modelli di distribuzione molecolare all’interno degli organi di piccoli insetti. Infatti, poiché i lipidi sono distribuiti sia nel tessuto cerebrale che nei corpi grassi delle teste di Drosophila, gli approcci lipidomici convenzionali basati sulla cromatografia liquida e sulla spettro…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy e Mayan Hein sono supportati dal programma di ricerca estiva CUNY della Sloan Foundation (CSURP). Jun Yin è supportato dal programma di ricerca intramurale del National Institutes of Health Project Number 1ZIANS003137. Il supporto per questo progetto è stato fornito da un premio PSC-CUNY a Ye He e Rinat Abzalimov, finanziato congiuntamente da The Professional Staff Congress e The City University di New York.
Materials
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) | Millipore Sigma Aldrich | 85707-1G-F | |
| Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5 | Fisher Scientific | NC9464347 | |
| Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
| autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
| Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | AC219095000 | ||
| Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
| Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
| FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
| SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
| Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
| Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |
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