إعداد العينات للتحليل السريع للدهون في دماغ ذبابة الفاكهة باستخدام التصوير الطيفي الكتلي للارتزاز / التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة
Summary
الهدف من هذا البروتوكول هو توفير إرشادات مفصلة حول إعداد العينات المناسبة لتحليل الدهون والمستقلب في الأنسجة الصغيرة ، مثل دماغ ذبابة الفاكهة ، باستخدام تصوير الطيف الكتلي بالامتزاز / التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI).
Abstract
تنميط الدهون ، أو الدهون ، هي تقنية راسخة تستخدم لدراسة محتوى الدهون بالكامل في الخلية أو الأنسجة. المعلومات المكتسبة من الدهون ذات قيمة في دراسة المسارات التي ينطوي عليها التطور والمرض والتمثيل الغذائي الخلوي. ساعدت العديد من الأدوات والأجهزة مشاريع الدهون ، وأبرزها مجموعات مختلفة من قياس الطيف الكتلي وتقنيات الكروماتوغرافيا السائلة. وقد برز مؤخرا التصوير الطيفي الكتلي للامتزاز بمساعدة المصفوفة/التأين بالليزر (MALDI MSI) كتقنية تصوير قوية تكمل النهج التقليدية. توفر هذه التقنية الجديدة معلومات فريدة عن التوزيع المكاني للدهون داخل مقصورات الأنسجة ، والتي لم يكن من الممكن تحقيقها في السابق دون استخدام تعديلات مفرطة. يعد إعداد عينة من نهج MALDI MSI أمرا بالغ الأهمية ، وبالتالي فهو محور تركيز هذه الورقة. تقدم هذه الورقة تحليلا سريعا للدهون لعدد كبير من أدمغة ذبابة الفاكهة المضمنة في مركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) لتوفير بروتوكول مفصل لإعداد الأنسجة الصغيرة لتحليل الدهون أو الأيض وتحليل الجزيئات الصغيرة من خلال MALDI MSI.
Introduction
تشارك الدهون في مجموعة واسعة من العمليات البيولوجية ويمكن تصنيفها على نطاق واسع إلى خمس فئات بناء على تنوعها الهيكلي: الأحماض الدهنية ، الدهون الثلاثية (TAGs) ، الدهون الفوسفاتية ، دهون الستيرول ، والدهون السفينغولية1. الوظائف الأساسية للدهون هي توفير مصادر الطاقة للعمليات البيولوجية (أي TAGs) وتشكيل الأغشية الخلوية (أي الدهون الفوسفاتية والكوليسترول). ومع ذلك ، فقد لوحظت أدوار إضافية للدهون في التنمية والأمراض ، وتمت دراستها على نطاق واسع في مجال الطب الحيوي. على سبيل المثال ، أظهرت التقارير أن الأحماض الدهنية ذات الأطوال المختلفة قد يكون لها أدوار علاجية فريدة. يمكن أن تشارك سلاسل الأحماض الدهنية القصيرة في آليات الدفاع ضد أمراض المناعة الذاتية ، وتنتج سلاسل الأحماض الدهنية متوسطة الطول مستقلبات يمكن أن تخفف من النوبات ، وتولد سلاسل الأحماض الدهنية الطويلة مستقلبات يمكن استخدامها لعلاج اضطرابات التمثيل الغذائي2. في الجهاز العصبي ، ثبت أن الكوليسترول المشتق من الدبقية والدهون الفوسفاتية أمر حيوي لتكوين التشابك العصبي 3,4. وقد أظهرت أنواع أخرى من الدهون واعدة في التطبيقات الطبية، بما في ذلك الدهون السفينغولية المستخدمة في أنظمة توصيل الأدوية والسكريات المستخدمة لدعم الجهاز المناعي5،6. جعلت الأدوار العديدة والتطبيقات العلاجية المحتملة للدهون في المجال الطبي الحيوي الدهون – دراسة مسارات وتفاعلات الدهون الخلوية – مجالا حاسما ومتزايد الأهمية.
تستخدم Lipidomics الكيمياء التحليلية لدراسة الدهون على نطاق واسع. تعتمد الطرق التجريبية الرئيسية المستخدمة في علم الدهون على قياس الطيف الكتلي (MS) إلى جانب مختلف تقنيات الكروماتوغرافيا والتنقل الأيوني 7,8. يعد استخدام التصلب المتعدد في المنطقة مفيدا نظرا لخصوصيته العالية وحساسيته وسرعة اكتسابه وقدراته الفريدة على (1) اكتشاف الدهون ومستقلبات الدهون التي تحدث حتى عند المستويات المنخفضة والعابرة ، (2) اكتشاف مئات المركبات الدهنية المختلفة في تجربة واحدة ، (3) تحديد الدهون غير المعروفة سابقا ، و (4) التمييز بين أيزومرات الدهون. من بين التطورات في مرض التصلب العصبي المتعدد، بما في ذلك التأين بالرش الكهربائي (DESI)، وMALDI، وقياس الطيف الكتلي الأيوني الثانوي (SIMS)، برز مالدي MSI كتقنية تصوير قوية تكمل النهج التقليدية القائمة على التصلب المتعدد من خلال توفير معلومات فريدة عن التوزيع المكاني للدهون داخل مقصورات الأنسجة 9,10.
يتكون سير العمل النموذجي لعلم الدهون من إعداد العينات ، والحصول على البيانات باستخدام تقنية قياس الطيف الكتلي ، وتحليل البيانات11. أدت دراسة الدهون والمستقلبات في العينات إلى ظهور تقنيات لفهم الظروف الفسيولوجية والمرضية لعمليات التمثيل الغذائي في الكائنات الحية. في حين أن فهم التفاعلات البيولوجية أمر مهم ، فإن حساسية الدهون والمستقلبات تجعل من الصعب تصويرها وتحديدها دون أصباغ أو أي تعديل آخر. قد تؤدي التغيرات في مستويات الأيض أو توزيعه إلى تغيرات في النمط الظاهري. إحدى الأدوات المستخدمة في التنميط الأيضي هي MALDI MSI ، وهي تقنية تصوير في الموقع خالية من الملصقات قادرة على اكتشاف مئات الجزيئات في وقت واحد. يسمح تصوير MALDI بتصور المستقلبات والدهون في العينات مع الحفاظ على سلامتها وتوزيعها المكاني. تضمنت التكنولوجيا السابقة لتحديد ملامح الدهون استخدام المواد الكيميائية المشعة لرسم خريطة للدهون بشكل فردي ، في حين أن تصوير MALDI يتخلى عن ذلك ويسمح بالكشف عن مجموعة من الدهون في وقت واحد.
يلعب استقلاب الدهون والتوازن وظائف مهمة في فسيولوجيا الخلية ، مثل صيانة الجهاز العصبي وتطويره. أحد الجوانب الأساسية لعملية التمثيل الغذائي للدهون في الجهاز العصبي هو نقل الدهون بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية ، والتي يتم توسطها بواسطة البروتينات الدهنية الحاملة الجزيئية ، بما في ذلك البروتين الدهني منخفض الكثافة (VLDL) ، والبروتينات الدهنية منخفضة الكثافة (LDL) ، والبروتينات الدهنية عالية الكثافة (HDL) 12. تحتوي البروتينات الدهنية على البروتينات الشحمية (Apo) ، مثل ApoB و ApoD ، والتي تعمل ككتل هيكلية لشحنات الدهون وكروابط لمستقبلات البروتين الدهني. يتضمن الحديث المتبادل بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية للدهون العديد من اللاعبين مثل ApoD و ApoE و ApoJ المشتقة من الخلايا الدبقية ، ومستقبلات LDL العصبية (LDLRs) 13,14. في ذبابة الفاكهة ، أبوليبوفورين ، وهو عضو في عائلة ApoB ، هو الناقل الرئيسي للدهون الدموي15. يحتوي Apolipophorin على مستقبلين ليبوفورين مرتبطين ارتباطا وثيقا (LpRs) ، LpR1 و LpR2 ، وهما متجانسان ل LDLR الثدييات15,16. في دراسات سابقة ، تم اكتشاف ليبوكالين جليال لازاريلو (GLaz) الذي تفرز الخلايا النجمية ، وهو تجانس ذبابة الفاكهة من ApoD البشري ، ومستقبلاته العصبية LpR1 للتوسط بشكل تعاوني في نقل الدهون بين الخلايا العصبية الدبقية ، وبالتالي تنظيم مورفوجينيسيس التشعبات17. لذلك ، تم التكهن بأن فقدان LpR1 سيؤدي إلى انخفاض في محتوى الدهون الكلي في دماغ ذبابة الفاكهة. سيكون MALDI MSI أداة مناسبة لتحديد ملامح محتويات الدهون في الأنسجة الصغيرة من أدمغة ذبابة ذبابة الفاكهة المتحولة والبرية LpR1−/− ، كما هو موضح في هذه الدراسة.
على الرغم من الشعبية المتزايدة ل MALDI MSI ، فإن التكلفة العالية للأداة وتعقيدها التجريبي غالبا ما يعوقان تنفيذه في المختبرات الفردية. وبالتالي ، يتم إجراء معظم دراسات MALDI MSI باستخدام المرافق الأساسية المشتركة. كما هو الحال مع التطبيقات الأخرى ل MALDI MSI ، فإن عملية إعداد العينات الدقيقة للدهون أمر بالغ الأهمية لتحقيق نتائج موثوقة. ومع ذلك ، نظرا لأن إعداد شريحة العينة يتم إجراؤه عادة في مختبرات الأبحاث الفردية ، فهناك احتمال حدوث اختلاف في اكتساب MALDI MSI. لمكافحة هذا ، تهدف هذه الورقة إلى توفير بروتوكول مفصل لإعداد عينات من العينات البيولوجية الصغيرة قبل قياس MALDI MSI باستخدام تحليل الدهون لمجموعة كبيرة من أدمغة ذبابة الفاكهة البالغة في وضع الأيونات الإيجابية كمثال11,17. ومع ذلك ، يتم الكشف عن بعض فئات الدهون الفوسفاتية وغالبية المستقلبات الصغيرة بشكل إيجابي عن طريق تصوير MALDI في وضع الأيونات السالبة ، والذي تم وصفه سابقا11. لذلك ، من خلال هاتين الدراستين المثاليتين ، نأمل في توفير بروتوكولات مفصلة لإعداد العينات من مجموعات مختلفة: الأنسجة الكبيرة القائمة بذاتها مقابل الأنسجة الصغيرة المضمنة ، وتركيب الذوبان مقابل التركيب بالانزلاق الدافئ ، ووضع الأيونات الإيجابية مقابل وضع الأيونات السالبة.
Protocol
Representative Results
Discussion
كما هو موضح في الدراسة حول الاختلافات في تكوين الدهون في أدمغة ذبابة الفاكهة المتحولة والبرية ، يمكن أن يكون MALDI MSI تقنية تصوير قيمة خالية من الملصقات للتحليل في الموقع لأنماط التوزيع الجزيئي داخل أعضاء الحشرات الصغيرة. في الواقع ، نظرا لأن الدهون موزعة في كل من أنسجة المخ والأجس?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم Yuki X. Chen و Kelly Veerasammy و Mayan Hein من قبل برنامج الأبحاث الصيفي لمؤسسة سلون CUNY (CSURP). يتم دعم جون يين من قبل برنامج البحوث الداخلية للمعاهد الوطنية للصحة رقم المشروع 1ZIANS003137. تم تقديم الدعم لهذا المشروع من خلال جائزة PSC-CUNY إلى Ye He و Rinat Abzalimov ، بتمويل مشترك من مؤتمر الموظفين المحترفين وجامعة مدينة نيويورك.
Materials
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) | Millipore Sigma Aldrich | 85707-1G-F | |
| Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5 | Fisher Scientific | NC9464347 | |
| Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
| autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
| Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | AC219095000 | ||
| Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
| Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
| FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
| SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
| Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
| Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |
References
- Park, J., et al. Bioactive lipids and their derivatives in biomedical applications. Biomolecules & Therapeutics. 29 (5), 465-482 (2021).
- Augustin, K., et al. Mechanisms of action for the medium-chain triglyceride ketogenic diet in neurological and metabolic disorders. Lancet Neurology. 17 (1), 84-93 (2018).
- Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
- Mauch, D. H., et al. Cns synaptogenesis promoted by glia-derived cholesterol. Science. 294 (5545), 1354-1357 (2001).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
- Zhou, F., Ciric, B., Zhang, G. X., Rostami, A. Immunotherapy using lipopolysaccharide-stimulated bone marrow-derived dendritic cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis. Clinical and Experimental Immunology. 178 (3), 447-458 (2014).
- Carrasco-Pancorbo, A., Navas-Iglesias, N., Cuadros-Rodriguez, L. From lipid analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part I: Modern lipid analysis. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (3), 263-278 (2009).
- Navas-Iglesias, N., Carrasco-Pancorbo, A., Cuadros-Rodriguez, L. From lipids analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part II: Analytical lipidomics. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (4), 393-403 (2009).
- Yang, K., Han, X. Lipidomics: Techniques, applications, and outcomes related to biomedical sciences. Trends in Biochemical Sciences. 41 (11), 954-969 (2016).
- Norris, J. L., Caprioli, R. M. Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research. Chemical Reviews. 113 (4), 2309-2342 (2013).
- Veerasammy, K., et al. Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging. Journal of Visualized Experiments. (166), e62008 (2020).
- Tracey, T. J., Steyn, F. J., Wolvetang, E. J., Ngo, S. T. Neuronal lipid metabolism: Multiple pathways driving functional outcomes in health and disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 10 (2018).
- Jackson, C. L., Walch, L., Verbavatz, J. M. Lipids and their trafficking: An integral part of cellular organization. Developmental Cell. 39 (2), 139-153 (2016).
- Wang, H., Eckel, R. H. What are lipoproteins doing in the brain. Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (1), 8-14 (2014).
- Palm, W., et al. Lipoproteins in Drosophila melanogaster-Assembly, function, and influence on tissue lipid composition. PLoS Genetics. 8 (7), 1002828 (2012).
- Parra-Peralbo, E., Culi, J. Drosophila lipophorin receptors mediate the uptake of neutral lipids in oocytes and imaginal disc cells by an endocytosis-independent mechanism. PLoS Genetics. 7 (2), 1001297 (2011).
- Yin, J., et al. Brain-specific lipoprotein receptors interact with astrocyte derived apolipoprotein and mediate neuron-glia lipid shuttling. Nature Communications. 12 (1), 2408 (2021).
- Tuthill, B. F., Searcy, L. A., Yost, R. A., Musselman, L. P. Tissue-specific analysis of lipid species in Drosophila during overnutrition by UHPLC-MS/MS and MALDI-MSI. Journal of Lipid Research. 61 (3), 275-290 (2020).
- Kaya, I., Jennische, E., Lange, S., Malmberg, P. Multimodal chemical imaging of a single brain tissue section using ToF-SIMS, MALDI-ToF and immuno/histochemical staining. Analyst. 146 (4), 1169-1177 (2021).
- Phan, N. T., Fletcher, J. S., Ewing, A. G. Lipid structural effects of oral administration of methylphenidate in Drosophila brain by secondary ion mass spectrometry imaging. Analytical Chemistry. 87 (8), 4063-4071 (2015).
- Dienel, G. A. Metabolomic and imaging mass spectrometric assays of labile brain metabolites: Critical importance of brain harvest procedures. Neurochemical Research. 45 (11), 2586-2606 (2020).
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: Practical aspects of sample preparation. Journal of Mass Spectrometry. 38 (7), 699-708 (2003).
- Phan, N. T., Mohammadi, A. S., Dowlatshahi Pour, M., Ewing, A. G. Laser desorption ionization mass spectrometry imaging of Drosophila brain using matrix sublimation versus modification with nanoparticles. Analytical Chemistry. 88 (3), 1734-1741 (2016).
- Niehoff, A. C., et al. Analysis of Drosophila lipids by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging. Analytical Chemistry. 86 (22), 11086-11092 (2014).
- Enomoto, Y., Nt An, P., Yamaguchi, M., Fukusaki, E., Shimma, S. Mass spectrometric imaging of GABA in the Drosophila melanogaster adult head. Analytical Sciences. 34 (9), 1055-1059 (2018).
- Yang, E., Gamberi, C., Chaurand, P. Mapping the fly malpighian tubule lipidome by imaging mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 54 (6), 557-566 (2019).
- Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. Advances in mass spectrometry for lipidomics. Annual Review of Analytical Chemistry. 3, 433-465 (2010).
- Han, X. Lipidomics for studying metabolism. Nature Reviews Endocrinology. 12 (11), 668-679 (2016).
- Wang, M., Wang, C., Han, X. Selection of internal standards for accurate quantification of complex lipid species in biological extracts by electrospray ionization mass spectrometry-What, how and why. Mass Spectrometry Reviews. 36 (6), 693-714 (2017).
