使用基质辅助激光解吸/电离质谱成像在 果蝇 脑中快速脂质分析的样品制备
Summary
该协议的目的是使用基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱成像，为小组织（如 果蝇 脑）中的脂质和代谢物分析提供适当的样品制备的详细指导。
Abstract
脂质分析或脂质组学是一种成熟的技术，用于研究细胞或组织的整个脂质含量。从脂质组学获得的信息对于研究参与发育，疾病和细胞代谢的途径很有价值。许多工具和仪器都有助于脂质组学项目，最值得注意的是质谱和液相色谱技术的各种组合。基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI MSI）最近已成为一种强大的成像技术，可以补充传统方法。这种新技术提供了关于组织区室内脂质空间分布的独特信息，这在以前是没有使用过度修饰的情况下无法实现的。MALDI MSI方法的样品制备至关重要，因此是本文的重点。本文对嵌入在最佳切割温度化合物（OCT）中的大量 果蝇 脑进行快速脂质分析，为通过MALDI MSI制备脂质分析或代谢物和小分子分析的小组织提供了详细的方案。
Introduction
脂质参与广泛的生物过程，根据其结构多样性可大致分为五类：脂肪酸，三酰基甘油（TAGs），磷脂，甾醇脂质和鞘脂1。脂质的基本功能是为生物过程（即TAG）提供能量来源并形成细胞膜（即磷脂和胆固醇）。然而，脂质在发育和疾病中的其他作用已被注意到，并且在生物医学领域已被广泛研究。例如，报告显示，不同长度的脂肪酸可能具有独特的治疗作用。短脂肪酸链可以参与针对自身免疫性疾病的防御机制，中等长度的脂肪酸链产生可以减轻癫痫发作的代谢物，长脂肪酸链产生可用于治疗代谢紊乱的代谢物2。在神经系统中，神经胶质细胞衍生的胆固醇和磷脂已被证明对突触发生至关重要3，4。其他类型的脂质在医疗应用中显示出前景，包括用于药物输送系统的鞘脂和用于支持免疫系统的糖脂5，6。脂质在生物医学领域的众多作用和潜在的治疗应用使得脂质组学-细胞脂质的通路和相互作用的研究-成为一个关键且日益重要的领域。
脂质组学利用分析化学来大规模研究脂质组。脂质组学中使用的主要实验方法基于质谱（MS）结合各种色谱和离子淌度技术7，8。MS在该领域的使用是有利的，因为它具有高特异性和敏感性，获取速度以及（1）检测即使在低水平和瞬时水平下也发生的脂质和脂质代谢物的独特能力，（2）在单个实验中检测数百种不同的脂质化合物，（3）识别以前未知的脂质，以及（4）区分脂质异构体。在MS的发展中，包括解吸电喷雾电离（DESI），MALDI和二次离子质谱（SIMS），MALDI MSI已成为一种强大的成像技术，通过提供有关组织隔室内脂质空间分布的独特信息来补充传统的基于MS的方法9，10。
脂质组学的典型工作流程包括样品制备、使用质谱技术进行数据采集和数据分析11.对样品中脂质和代谢物的研究导致了了解生物体代谢过程的生理和病理状况的技术的出现。虽然了解生物相互作用很重要，但脂质和代谢物的敏感性使它们难以在没有染料或其他修饰的情况下成像和鉴定。代谢物水平或分布的变化可能导致表型变化。用于代谢组学分析的一种工具是MALDI MSI，这是一种无标记 的原位 成像技术，能够同时检测数百个分子。MALDI成像允许样品中代谢物和脂质的可视化，同时保持其完整性和空间分布。以前的脂质分析技术涉及使用放射性化学物质单独绘制脂质图，而MALDI成像则放弃了这一点，并允许同时检测一系列脂质。
脂质代谢和体内平衡在细胞生理学中起着重要作用，例如神经系统的维持和发展。神经系统脂质代谢的一个重要方面是神经元和神经胶质细胞之间的脂质穿梭，其由分子载体脂蛋白介导，包括极低密度脂蛋白（VLDL），低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）12。脂蛋白含有载脂蛋白（Apo），如ApoB和ApoD，其功能是脂质货物的结构块和脂蛋白受体的配体。脂质的神经元 – 神经胶质细胞串扰涉及多个参与者，例如神经胶质细胞衍生的ApoD，ApoE和ApoJ，以及它们的神经元LDL受体（LDLRs）13，14。在 果蝇中，ApoB家族的成员阿波利波弗林是主要的血红素脂质载体15。载脂蛋白具有两个密切相关的脂蛋白受体（LpR），LpR1和LpR2，它们是哺乳动物LDLR15，16的同源物。在以前的研究中，发现星形胶质细胞分泌的脂质细胞分泌的胶质拉扎里洛（GLaz）是人ApoD的 果蝇 同源物，其神经元受体LpR1可以合作介导神经元 – 胶质细胞脂质穿梭，从而调节树突形态发生17。因此，据推测，LpR1的丢失会导致 果蝇 大脑中整体脂质含量的降低。MALDI MSI将是分析 LpR1−/− 突变型果蝇脑和野生型 果蝇 脑小组织中脂质含量的合适工具，如本研究所示。
尽管MALDI MSI越来越受欢迎，但该仪器的高成本和实验复杂性经常阻碍其在单个实验室中的实施。因此，大多数MALDI MSI研究都是使用共享的核心设施进行的。与 MALDI MSI 的其他应用一样，仔细的脂质组学样品制备过程对于获得可靠的结果至关重要。然而，由于样品载玻片制备通常在单个研究实验室进行，因此MALDI MSI采集可能存在差异。为了解决这个问题，本文旨在为MALDI MSI测量之前的小生物样品的样品制备提供详细的方案，例如11，17，17，使用对一大群成年果蝇脑进行脂质分析。然而，一些磷脂类和大多数小代谢物在负离子模式下通过MALDI成像被有利地检测到，这在前面11中已经描述过。因此，通过这两个示例研究，我们希望提供各种组合的详细样品制备方案：独立式大组织与包埋的小组织，解冻安装与暖玻片安装，以及正离子模式与负离子模式。
Protocol
Representative Results
Discussion
正如对突变型和野生型果蝇大脑中脂质组成变化的研究所证明的那样，MALDI MSI可以成为一种有价值的无标记成像技术，用于原位分析小昆虫器官内的分子分布模式。事实上，由于脂质分布在果蝇头的脑组织和脂肪体中，因此当使用全头提取时，基于液相色谱和质谱（LC-MS）的传统脂质组学方法只能检测来自两个区域的组合信号。从广义上讲，对于LC-MS方法18，?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
陈由纪、凯莉·维拉萨米和玛雅·海因得到了斯隆基金会纽约市立大学暑期研究计划（CSURP）的支持。尹俊仁得到了美国国立卫生研究院项目编号1ZIANS003137的校内研究项目的支持。该项目由PSC-CUNY奖提供给叶赫和里纳特·阿布扎利莫夫，由专业人员大会和纽约市立大学共同资助。
Materials
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) | Millipore Sigma Aldrich | 85707-1G-F | |
| Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5 | Fisher Scientific | NC9464347 | |
| Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
| autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
| Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | AC219095000 | ||
| Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
| Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
| FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
| SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
| Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
| Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |
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