Het doel van dit protocol is om gedetailleerde richtlijnen te geven over de juiste monstervoorbereiding voor lipide- en metabolietanalyse in kleine weefsels, zoals de Drosophila-hersenen , met behulp van matrixondersteunde laserdesorptie / ionisatie (MALDI) massaspectrometrie beeldvorming.
Lipid profiling, of lipidomics, is een gevestigde techniek die wordt gebruikt om het volledige lipidegehalte van een cel of weefsel te bestuderen. Informatie verkregen uit lipidomics is waardevol bij het bestuderen van de paden die betrokken zijn bij ontwikkeling, ziekte en cellulair metabolisme. Veel gereedschappen en instrumentaties hebben lipidomics-projecten ondersteund, met name verschillende combinaties van massaspectrometrie en vloeistofchromatografietechnieken. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI) is onlangs naar voren gekomen als een krachtige beeldvormingstechniek die conventionele benaderingen aanvult. Deze nieuwe techniek biedt unieke informatie over de ruimtelijke verdeling van lipiden binnen weefselcompartimenten, die voorheen onbereikbaar was zonder het gebruik van overmatige modificaties. De voorbeeldvoorbereiding van de MSI-aanpak van MALDI is van cruciaal belang en is daarom de focus van dit artikel. Dit artikel presenteert een snelle lipidenanalyse van een groot aantal Drosophila-hersenen ingebed in optimale snijtemperatuurverbinding (OCT) om een gedetailleerd protocol te bieden voor de voorbereiding van kleine weefsels voor lipidenanalyse of metaboliet- en kleine molecuulanalyse via MALDI MSI.
Lipiden zijn betrokken bij een breed scala aan biologische processen en kunnen grofweg worden ingedeeld in vijf categorieën op basis van hun structurele diversiteit: vetzuren, triacylglycerolen (TAGs), fosfolipiden, sterollipiden en sfingolipiden1. De fundamentele functies van lipiden zijn het leveren van energiebronnen voor biologische processen (d.w.z. TAGs) en het vormen van cellulaire membranen (d.w.z. fosfolipiden en cholesterol). Er zijn echter aanvullende rollen van lipiden opgemerkt in ontwikkeling en ziekten en zijn uitgebreid bestudeerd op biomedisch gebied. Rapporten hebben bijvoorbeeld aangetoond dat vetzuren van verschillende lengtes unieke therapeutische rollen kunnen hebben. Korte vetzuurketens kunnen betrokken zijn bij verdedigingsmechanismen tegen auto-immuunziekten, middellange vetzuurketens produceren metabolieten die aanvallen kunnen verminderen en lange vetzuurketens genereren metabolieten die kunnen worden gebruikt om metabole stoornissen te behandelen2. In het zenuwstelsel is aangetoond dat van glia afgeleide cholesterol en fosfolipiden van vitaal belang zijn voor synaptogenese 3,4. Andere soorten lipiden zijn veelbelovend gebleken in medische toepassingen, waaronder sfingolipiden die worden gebruikt in medicijnafgiftesystemen en sacharines die worden gebruikt om het immuunsysteem te ondersteunen 5,6. De talrijke rollen en potentiële therapeutische toepassingen van lipiden op biomedisch gebied hebben lipidomics – de studie van de routes en interacties van cellulaire lipiden – tot een kritisch en steeds belangrijker veld gemaakt.
Lipidomics maakt gebruik van analytische chemie om het lipidoom op grote schaal te bestuderen. De belangrijkste experimentele methoden die in lipidomics worden gebruikt, zijn gebaseerd op massaspectrometrie (MS) in combinatie met verschillende chromatografie- en ionenmobiliteitstechnieken 7,8. Het gebruik van MS in het gebied is voordelig vanwege de hoge specificiteit en gevoeligheid, de snelheid van verwerving en de unieke mogelijkheden om (1) lipiden en lipidemetabolieten te detecteren die zelfs op lage en voorbijgaande niveaus voorkomen, (2) honderden verschillende lipideverbindingen in een enkel experiment te detecteren, (3) voorheen onbekende lipiden te identificeren en (4) onderscheid te maken tussen lipide-isomeren. Onder de ontwikkelingen in MS, waaronder desorptie-elektrospray-ionisatie (DESI), MALDI en secundaire ionenmassaspectrometrie (SIMS), is MALDI MSI naar voren gekomen als een krachtige beeldvormingstechniek die conventionele MS-gebaseerde benaderingen aanvult door unieke informatie te verstrekken over de ruimtelijke verdeling van lipiden binnen weefselcompartimenten 9,10.
De typische workflow van lipidomics bestaat uit monstervoorbereiding, data-acquisitie met behulp van massaspectrometrietechnologie en data-analyse11. De studie van lipiden en metabolieten in monsters heeft geleid tot de opkomst van technieken om de fysiologische en pathologische omstandigheden van metabole processen in organismen te begrijpen. Hoewel het begrijpen van biologische interacties belangrijk is, maakt de gevoeligheid van lipiden en metabolieten ze moeilijk in beeld te brengen en te identificeren zonder kleurstoffen of andere modificaties. Veranderingen in metabolietniveaus of distributie kunnen leiden tot fenotypische veranderingen. Een hulpmiddel dat wordt gebruikt voor metabolomische profilering is MALDI MSI, een labelvrije, in situ beeldvormingstechniek die in staat is om honderden moleculen tegelijkertijd te detecteren. MALDI-beeldvorming maakt de visualisatie van metabolieten en lipiden in monsters mogelijk met behoud van hun integriteit en ruimtelijke verdeling. Eerdere technologie voor lipidenprofilering omvatte het gebruik van radioactieve chemicaliën om lipiden individueel in kaart te brengen, terwijl MALDI-beeldvorming hiervan afziet en tegelijkertijd een reeks lipiden kan detecteren.
Lipidenmetabolisme en homeostase spelen belangrijke functies in de celfysiologie, zoals het onderhoud en de ontwikkeling van het zenuwstelsel. Een essentieel aspect van het lipidenmetabolisme van het zenuwstelsel is de lipide-shuttling tussen neuronen en gliacellen, die wordt gemedieerd door moleculaire dragerlipoproteïnen, waaronder lipoproteïne met zeer lage dichtheid (VLDL), lipoproteïnen met lage dichtheid (LDL) en lipoproteïnen met hoge dichtheid (HDL)12. Lipoproteïnen bevatten apolipoproteïnen (Apo), zoals ApoB en ApoD, die functioneren als structurele blokken lipidelading en als liganden voor lipoproteïnereceptoren. De neuron-glia kruisverwijzing van lipiden omvat meerdere spelers zoals glia-afgeleide ApoD, ApoE en ApoJ, en hun neuronale LDL-receptoren (LDLRs)13,14. In Drosophila is apolipophorine, een lid van de ApoB-familie, een belangrijke hemolymfe-lipidedrager15. Apolipophorine heeft twee nauw verwante lipoforinereceptoren (LpR’s), LpR1 en LpR2, die homologen zijn van zoogdier LDLR15,16. In eerdere studies werden de astrocyten-uitgescheiden lipocaline Glial Lazarillo (GLaz), een Drosophila homoloog van menselijk ApoD, en zijn neuronale receptor LpR1 ontdekt om coöperatief neuron-glia lipide shuttling te bemiddelen, waardoor de dendrietmorfogenese wordt gereguleerd17. Daarom werd gespeculeerd dat het verlies van LpR1 een afname van het totale lipidengehalte in de Drosophila-hersenen zou veroorzaken. MALDI MSI zou een geschikt hulpmiddel zijn voor het profileren van de lipide-inhoud in kleine weefsels van LpR1−/− mutante en wild-type Drosophila-hersenen, zoals aangetoond in deze studie.
Ondanks de groeiende populariteit van MALDI MSI, belemmeren de hoge kosten en experimentele complexiteit van het instrument vaak de implementatie ervan in individuele laboratoria. De meeste MSI-onderzoeken van MALDI worden dus uitgevoerd met behulp van gedeelde kernfaciliteiten. Net als bij andere toepassingen van MALDI MSI is een zorgvuldig monstervoorbereidingsproces voor lipidomics van cruciaal belang om betrouwbare resultaten te bereiken. Omdat monsterdiapreparatie echter meestal wordt uitgevoerd in individuele onderzoekslaboratoria, is er een mogelijkheid van variatie in MALDI MSI-acquisitie. Om dit te bestrijden, beoogt dit artikel een gedetailleerd protocol te bieden voor de monstervoorbereiding van kleine biologische monsters voorafgaand aan MALDI MSI-meting met behulp van lipidenanalyse van een grote groep volwassen Drosophila-hersenen in positieve ionenmodus als voorbeeld11,17. Sommige fosfolipideklassen en de meerderheid van de kleine metabolieten worden echter gunstig gedetecteerd door MALDI-beeldvorming in negatieve ionenmodus, die eerder werd beschreven11. Daarom hopen we met deze twee voorbeeldstudies gedetailleerde monstervoorbereidingsprotocollen van verschillende combinaties te bieden: vrijstaand groot weefsel versus ingebed klein weefsel, dooimontage versus warmschuifmontage en positieve ionmodus versus negatieve ionmodus.
Zoals aangetoond in de studie naar de variaties in lipidesamenstelling in mutante en wild-type Drosophila hersenen, kan MALDI MSI een waardevolle labelvrije beeldvormingstechniek zijn voor in situ analyse van moleculaire distributiepatronen in organen van kleine insecten. Inderdaad, omdat lipiden worden verdeeld in zowel het hersenweefsel als het vetlichaam van Drosophila-hoofden, kunnen conventionele lipidomics-benaderingen op basis van vloeistofchromatografie en massaspectrometrie (LC-MS) all…
The authors have nothing to disclose.
Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy en Maya Hein worden ondersteund door de Sloan Foundation CUNY Summer Research Program (CSURP). Jun Yin wordt ondersteund door het intramurale onderzoeksprogramma van het National Institutes of Health Project Number 1ZIANS003137. Ondersteuning voor dit project werd geleverd door een PSC-CUNY Award aan Ye He en Rinat Abzalimov, gezamenlijk gefinancierd door The Professional Staff Congress en The City University of New York.
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) | Millipore Sigma Aldrich | 85707-1G-F | |
Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5 | Fisher Scientific | NC9464347 | |
Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | AC219095000 | ||
Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |