Préparation d’échantillons pour analyse lipidique rapide dans le cerveau de drosophile à l’aide de l’imagerie par spectrométrie de masse par désorption/ionisation laser assistée par matrice
Summary
L’objectif de ce protocole est de fournir des conseils détaillés sur la préparation appropriée des échantillons pour l’analyse des lipides et des métabolites dans de petits tissus, tels que le cerveau de la drosophile , en utilisant l’imagerie par spectrométrie de masse par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI).
Abstract
Le profilage lipidique, ou lipidomique, est une technique bien établie utilisée pour étudier la totalité du contenu lipidique d’une cellule ou d’un tissu. Les informations acquises à partir de la lipidomique sont précieuses pour étudier les voies impliquées dans le développement, la maladie et le métabolisme cellulaire. De nombreux outils et instruments ont contribué aux projets de lipidomique, notamment diverses combinaisons de techniques de spectrométrie de masse et de chromatographie liquide. L’imagerie par spectrométrie de masse par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI MSI) est récemment apparue comme une technique d’imagerie puissante qui complète les approches conventionnelles. Cette nouvelle technique fournit des informations uniques sur la distribution spatiale des lipides dans les compartiments tissulaires, ce qui était auparavant impossible sans l’utilisation de modifications excessives. La préparation de l’échantillon de l’approche MALDI MSI est essentielle et, par conséquent, est au centre de cet article. Cet article présente une analyse lipidique rapide d’un grand nombre de cerveaux de drosophiles intégrés dans un composé à température de coupe optimale (OCT) afin de fournir un protocole détaillé pour la préparation de petits tissus pour l’analyse lipidique ou l’analyse de métabolites et de petites molécules via MALDI MSI.
Introduction
Les lipides sont impliqués dans un large éventail de processus biologiques et peuvent être classés en cinq catégories en fonction de leur diversité structurelle: acides gras, triacylglycérols (TAG), phospholipides, lipides stéroliques et sphingolipides1. Les fonctions fondamentales des lipides sont de fournir des sources d’énergie pour les processus biologiques (c.-à-d. TAG) et de former des membranes cellulaires (phospholipides et cholestérol). Cependant, des rôles supplémentaires des lipides ont été notés dans le développement et les maladies, et ont été largement étudiés dans le domaine biomédical. Par exemple, des rapports ont montré que les acides gras de différentes longueurs peuvent avoir des rôles thérapeutiques uniques. Les chaînes d’acides gras courtes peuvent être impliquées dans les mécanismes de défense contre les maladies auto-immunes, les chaînes d’acides gras de longueur moyenne produisent des métabolites qui peuvent atténuer les crises et les longues chaînes d’acides gras génèrent des métabolites qui peuvent être utilisés pour traiter les troubles métaboliques2. Dans le système nerveux, le cholestérol et les phospholipides dérivés de la glie se sont révélés vitaux pour la synaptogenèse 3,4. D’autres types de lipides se sont révélés prometteurs dans des applications médicales, notamment les sphingolipides utilisés dans les systèmes d’administration de médicaments et les saccharolipides utilisés pour soutenir le système immunitaire 5,6. Les nombreux rôles et applications thérapeutiques potentielles des lipides dans le domaine biomédical ont fait de la lipidomique – l’étude des voies et des interactions des lipides cellulaires – un domaine critique et de plus en plus important.
La lipidomique utilise la chimie analytique pour étudier le lipidome à grande échelle. Les principales méthodes expérimentales utilisées en lipidomique sont basées sur la spectrométrie de masse (SM) couplée à diverses techniques de chromatographie et de mobilité ionique 7,8. L’utilisation de la SEP dans la région est avantageuse en raison de sa spécificité et de sa sensibilité élevées, de sa vitesse d’acquisition et de ses capacités uniques à (1) détecter les lipides et les métabolites lipidiques se produisant même à des niveaux faibles et transitoires, (2) détecter des centaines de composés lipidiques différents dans une seule expérience, (3) identifier des lipides auparavant inconnus et (4) distinguer les isomères lipidiques. Parmi les développements de la SEP, y compris l’ionisation par électropulvérisation par désorption (DESI), MALDI et la spectrométrie de masse à ions secondaires (SIMS), MALDI MSI est apparue comme une technique d’imagerie puissante qui complète les approches conventionnelles basées sur la SEP en fournissant des informations uniques sur la distribution spatiale des lipides dans les compartiments tissulaires 9,10.
Le flux de travail typique de la lipidomique comprend la préparation des échantillons, l’acquisition de données à l’aide de la technologie de spectrométrie de masse et l’analyse des données11. L’étude des lipides et des métabolites dans les échantillons a conduit à l’émergence de techniques pour comprendre les conditions physiologiques et pathologiques des processus métaboliques dans les organismes. Bien qu’il soit important de comprendre les interactions biologiques, la sensibilité des lipides et des métabolites les rend difficiles à imager et à identifier sans colorants ou autres modifications. Les changements dans les niveaux ou la distribution des métabolites peuvent entraîner des changements phénotypiques. Un outil utilisé pour le profilage métabolomique est MALDI MSI, une technique d’imagerie in situ sans marquage capable de détecter des centaines de molécules simultanément. L’imagerie MALDI permet de visualiser les métabolites et les lipides dans les échantillons tout en préservant leur intégrité et leur distribution spatiale. La technologie précédente pour le profilage lipidique impliquait l’utilisation de produits chimiques radioactifs pour cartographier individuellement les lipides, tandis que l’imagerie MALDI renonce à cela et permet la détection simultanée d’une gamme de lipides.
Le métabolisme des lipides et l’homéostasie jouent des fonctions importantes dans la physiologie cellulaire, telles que le maintien et le développement du système nerveux. Un aspect essentiel du métabolisme des lipides du système nerveux est la navette lipidique entre les neurones et les cellules gliales, qui est médiée par les lipoprotéines porteuses moléculaires, y compris les lipoprotéines de très basse densité (VLDL), les lipoprotéines de basse densité (LDL) et les lipoprotéines de haute densité (HDL)12. Les lipoprotéines contiennent des apolipoprotéines (Apo), telles que l’ApoB et l’ApoD, qui fonctionnent comme des blocs structurels de la cargaison lipidique et comme des ligands pour les récepteurs des lipoprotéines. La diaphonie neurone-glie des lipides implique plusieurs acteurs tels que l’ApoD, l’ApoE et l’ApoJ dérivés de la glie, et leurs récepteurs neuronaux LDL (LDLR)13,14. Chez la drosophile, l’apolipophorine, membre de la famille ApoB, est un important vecteur lipidique de l’hémolymphe15. L’apolipophorine a deux récepteurs de lipophorine étroitement liés (LpR), LpR1 et LpR2, qui sont des homologues de mammifères LDLR15,16. Dans des études antérieures, la lipocaline sécrétée par les astrocytes Glial Lazarillo (GLaz), un homologue de la drosophile de l’ApoD humain, et son récepteur neuronal LpR1 ont été découverts pour coopérer dans la navette lipidique neurone-glie, régulant ainsi la morphogenèse des dendrites17. Par conséquent, il a été spéculé que la perte de LpR1 entraînerait une diminution de la teneur globale en lipides dans le cerveau de la drosophile. MALDI MSI serait un outil approprié pour profiler les teneurs en lipides dans les petits tissus des cerveaux mutants LpR1−/− et de la drosophile de type sauvage, comme démontré dans cette étude.
Malgré la popularité croissante de MALDI MSI, le coût élevé et la complexité expérimentale de l’instrument entravent souvent sa mise en œuvre dans les laboratoires individuels. Ainsi, la plupart des études MALDI MSI sont menées à l’aide d’installations à cœur partagé. Comme pour les autres applications de MALDI MSI, un processus minutieux de préparation des échantillons pour la lipidomique est essentiel pour obtenir des résultats fiables. Cependant, étant donné que la préparation des lames d’échantillon est généralement effectuée dans des laboratoires de recherche individuels, il existe une possibilité de variation dans l’acquisition de MALDI MSI. Pour lutter contre cela, cet article vise à fournir un protocole détaillé pour la préparation d’échantillons de petits échantillons biologiques avant la mesure MALDI MSI en utilisant l’analyse lipidique d’un grand groupe de cerveaux adultes de drosophile en mode ion positif comme exemple11,17. Cependant, certaines classes de phospholipides et la majorité des petits métabolites sont favorablement détectés par imagerie MALDI en mode ion négatif, ce qui a été décrit précédemment11. Par conséquent, avec ces deux exemples d’études, nous espérons fournir des protocoles détaillés de préparation d’échantillons de diverses combinaisons: grand tissu autonome par rapport à un petit tissu intégré, montage par décongélation par rapport à un montage par glissière chaude, et mode ion positif par rapport à mode ion négatif.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comme démontré dans l’étude sur les variations de la composition lipidique dans les cerveaux mutants et sauvages de drosophiles, MALDI MSI peut être une technique d’imagerie sans marquage précieuse pour l’analyse in situ des modèles de distribution moléculaire dans les organes de petits insectes. En effet, étant donné que les lipides sont distribués à la fois dans le tissu cérébral et dans les corps adipeux des têtes de drosophile, les approches lipidomiques conventionnelles…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy et Mayan Hein sont soutenues par le programme de recherche d’été CUNY de la Sloan Foundation (CSURP). Jun Yin est soutenu par le programme de recherche intra-muros du projet numéro 1ZIANS003137 des National Institutes of Health. Le soutien à ce projet a été fourni par un prix PSC-CUNY à Ye He et Rinat Abzalimov, financé conjointement par le Congrès du personnel professionnel et l’Université de la ville de New York.
Materials
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) | Millipore Sigma Aldrich | 85707-1G-F | |
| Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5 | Fisher Scientific | NC9464347 | |
| Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
| autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
| Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | AC219095000 | ||
| Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
| Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
| FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
| SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
| Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
| Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |
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