Probenvorbereitung für die schnelle Lipidanalyse im Drosophila-Gehirn mittels matrixgestützter Laserdesorption/Ionisations-Massenspektrometrie-Bildgebung
Summary
Ziel dieses Protokolls ist es, detaillierte Anleitungen zur richtigen Probenvorbereitung für die Lipid- und Metabolitenanalyse in kleinen Geweben wie dem Drosophila-Gehirn unter Verwendung der matrixgestützten Laserdesorption / Ionisation (MALDI) Massenspektrometrie bereitzustellen.
Abstract
Lipid-Profiling oder Lipidomik ist eine etablierte Technik, die verwendet wird, um den gesamten Lipidgehalt einer Zelle oder eines Gewebes zu untersuchen. Informationen, die aus der Lipidomik gewonnen werden, sind wertvoll für die Untersuchung der Signalwege, die an Entwicklung, Krankheit und Zellstoffwechsel beteiligt sind. Viele Werkzeuge und Instrumente haben Lipidomik-Projekte unterstützt, vor allem verschiedene Kombinationen von Massenspektrometrie und Flüssigkeitschromatographie-Techniken. Die matrixgestützte Laserdesorptions-/Ionisations-Massenspektrometrie-Bildgebung (MALDI MSI) hat sich in jüngster Zeit als leistungsfähige Bildgebungstechnik herkömmlicher Ansätze herausgestellt. Diese neuartige Technik liefert einzigartige Informationen über die räumliche Verteilung von Lipiden innerhalb von Gewebekompartimenten, die bisher ohne übermäßige Modifikationen nicht erreichbar waren. Die Probenvorbereitung des MALDI-MSI-Ansatzes ist von entscheidender Bedeutung und steht daher im Mittelpunkt dieses Papiers. Dieser Artikel präsentiert eine schnelle Lipidanalyse einer großen Anzahl von Drosophila-Gehirnen , die in eine optimale Schnitttemperaturverbindung (OCT) eingebettet sind, um ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung kleiner Gewebe für die Lipidanalyse oder die Metaboliten- und niedermolekulare Analyse durch MALDI MSI bereitzustellen.
Introduction
Lipide sind an einer Vielzahl biologischer Prozesse beteiligt und können aufgrund ihrer strukturellen Vielfalt grob in fünf Kategorien eingeteilt werden: Fettsäuren, Triacylglycerole (TAGs), Phospholipide, Sterollipide und Sphingolipide1. Die grundlegenden Funktionen von Lipiden bestehen darin, Energiequellen für biologische Prozesse (dh TAGs) bereitzustellen und Zellmembranen zu bilden (dh Phospholipide und Cholesterin). Es wurden jedoch zusätzliche Rollen von Lipiden bei der Entwicklung und bei Krankheiten festgestellt und im biomedizinischen Bereich umfassend untersucht. Zum Beispiel haben Berichte gezeigt, dass Fettsäuren unterschiedlicher Länge einzigartige therapeutische Rollen haben können. Kurze Fettsäureketten können an Abwehrmechanismen gegen Autoimmunerkrankungen beteiligt sein, mittellange Fettsäureketten produzieren Metaboliten, die Anfälle mildern können, und lange Fettsäureketten erzeugen Metaboliten, die zur Behandlung von Stoffwechselstörungen eingesetzt werden können2. Im Nervensystem haben sich glia-abgeleitetes Cholesterin und Phospholipide als wichtig für die Synaptogenese erwiesen 3,4. Andere Arten von Lipiden haben sich in medizinischen Anwendungen als vielversprechend erwiesen, einschließlich Sphingolipide, die in Arzneimittelabgabesystemen verwendet werden, und Saccharolipide, die zur Unterstützung des Immunsystems verwendet werden 5,6. Die zahlreichen Rollen und potenziellen therapeutischen Anwendungen von Lipiden im biomedizinischen Bereich haben die Lipidomik – die Untersuchung der Wege und Wechselwirkungen zellulärer Lipide – zu einem kritischen und zunehmend wichtigen Bereich gemacht.
Die Lipidomik nutzt die analytische Chemie, um das Lipidom in großem Maßstab zu untersuchen. Die wichtigsten experimentellen Methoden, die in der Lipidomik verwendet werden, basieren auf Massenspektrometrie (MS) in Verbindung mit verschiedenen Chromatographie– und Ionenmobilitätstechniken 7,8. Die Verwendung von MS in diesem Bereich ist vorteilhaft aufgrund seiner hohen Spezifität und Sensitivität, Geschwindigkeit der Erfassung und einzigartigen Fähigkeiten, (1) Lipide und Lipidmetaboliten nachzuweisen, die auch bei niedrigen und vorübergehenden Konzentrationen auftreten, (2) Hunderte von verschiedenen Lipidverbindungen in einem einzigen Experiment nachzuweisen, (3) bisher unbekannte Lipide zu identifizieren und (4) zwischen Lipidisomeren zu unterscheiden. Unter den Entwicklungen in der MS, einschließlich Desorptionselektrospray-Ionisation (DESI), MALDI und Sekundärionen-Massenspektrometrie (SIMS), hat sich MALDI MSI als eine leistungsstarke Bildgebungstechnik herausgestellt, die herkömmliche MS-basierte Ansätze ergänzt, indem sie einzigartige Informationen über die räumliche Verteilung von Lipiden innerhalb der Gewebekompartimente 9,10 liefert.
Der typische Arbeitsablauf der Lipidomik besteht aus Probenvorbereitung, Datenerfassung mittels Massenspektrometrie-Technologie und Datenanalyse11. Die Untersuchung von Lipiden und Metaboliten in Proben hat zur Entstehung von Techniken geführt, um die physiologischen und pathologischen Bedingungen von Stoffwechselprozessen in Organismen zu verstehen. Während das Verständnis biologischer Wechselwirkungen wichtig ist, macht es die Empfindlichkeit von Lipiden und Metaboliten schwierig, sie ohne Farbstoffe oder andere Modifikationen abzubilden und zu identifizieren. Veränderungen der Metabolitenspiegel oder -verteilung können zu phänotypischen Veränderungen führen. Ein Werkzeug für das metabolomische Profiling ist MALDI MSI, ein markierungsfreies In-situ-Bildgebungsverfahren , das Hunderte von Molekülen gleichzeitig nachweisen kann. Die MALDI-Bildgebung ermöglicht die Visualisierung von Metaboliten und Lipiden in Proben unter Beibehaltung ihrer Integrität und räumlichen Verteilung. Frühere Technologien für die Lipidprofilierung beinhalteten die Verwendung radioaktiver Chemikalien, um Lipide individuell abzubilden, während die MALDI-Bildgebung darauf verzichtet und die gleichzeitige Detektion einer Reihe von Lipiden ermöglicht.
Fettstoffwechsel und Homöostase spielen wichtige Funktionen in der Zellphysiologie, wie die Erhaltung und Entwicklung des Nervensystems. Ein wesentlicher Aspekt des Lipidstoffwechsels des Nervensystems ist der Lipidtransfer zwischen Neuronen und Gliazellen, der durch molekulare Trägerlipoproteine vermittelt wird, einschließlich Very-Low-Density-Lipoprotein (VLDL), Low-Density-Lipoproteine (LDL) und High-Density-Lipoproteine (HDL)12. Lipoproteine enthalten Apolipoproteine (Apo) wie ApoB und ApoD, die als Strukturblöcke der Lipidfracht und als Liganden für Lipoproteinrezeptoren fungieren. Das Neuron-Glia-Crosstalk von Lipiden umfasst mehrere Akteure wie glia-abgeleitete ApoD, ApoE und ApoJ und ihre neuronalen LDL-Rezeptoren (LDLRs)13,14. Bei Drosophila ist Apolipophorin, ein Mitglied der ApoB-Familie, ein wichtiger Hämolymphlipidträger15. Apolipophorin hat zwei eng verwandte Lipophorinrezeptoren (LpR), LpR1 und LpR2, die Homologe von LDLR15,16 von Säugetieren sind. In früheren Studien wurde entdeckt, dass das Astrozyten-sezernierte Lipocalin Glial Lazarillo (GLaz), ein Drosophila-Homolog des menschlichen ApoD, und sein neuronaler Rezeptor LpR1 kooperativ das Neuron-Glia-Lipid-Shuttle vermitteln und so die Dendritenmorphogenese regulieren17. Daher wurde spekuliert, dass der Verlust von LpR1 zu einer Abnahme des Gesamtlipidgehalts im Drosophila-Gehirn führen würde. MALDI MSI wäre ein geeignetes Werkzeug, um den Lipidgehalt in kleinen Geweben von LpR1−/−-mutierten und Wildtyp-Drosophila-Gehirnen zu profilieren, wie in dieser Studie gezeigt.
Trotz der wachsenden Beliebtheit von MALDI MSI behindern die hohen Kosten und die experimentelle Komplexität des Instruments oft den Einsatz in einzelnen Laboratorien. Daher werden die meisten MALDI MSI-Studien mit gemeinsamen Core Facilities durchgeführt. Wie bei anderen Anwendungen von MALDI MSI ist ein sorgfältiger Probenvorbereitungsprozess für die Lipidomik entscheidend, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Da die Probenobjektträgervorbereitung jedoch in der Regel in einzelnen Forschungslabors durchgeführt wird, besteht die Möglichkeit von Abweichungen bei der Erfassung von MALDI MSI. Um dies zu bekämpfen, zielt dieses Papier darauf ab, ein detailliertes Protokoll für die Probenvorbereitung kleiner biologischer Proben vor der MALDI-MSI-Messung unter Verwendung der Lipidanalyse einer großen Gruppe erwachsener Drosophila-Gehirne im positiven Ionenmodus als Beispielbereitzustellen 11,17. Einige Phospholipidklassen und die Mehrheit der kleinen Metaboliten werden jedoch durch MALDI-Bildgebung im negativen Ionenmodus, der zuvor beschrieben wurde11, günstig nachgewiesen. Daher hoffen wir, mit diesen beiden Beispielstudien detaillierte Probenvorbereitungsprotokolle verschiedener Kombinationen bereitzustellen: freistehendes großes Gewebe versus eingebettetes kleines Gewebe, Taumontage versus Warmobjektträgermontage und positiver Ionenmodus versus negativer Ionenmodus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wie in der Studie über die Variationen der Lipidzusammensetzung in mutierten und Wildtyp-Drosophila-Gehirnen gezeigt wurde, kann MALDI MSI eine wertvolle markierungsfreie Bildgebungstechnik für die In-situ-Analyse molekularer Verteilungsmuster in Organen kleiner Insekten sein. Da Lipide sowohl im Hirngewebe als auch im Fettkörper von Drosophila-Köpfen verteilt sind, können herkömmliche Lipidomik-Ansätze, die auf Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie (LC-MS) basieren, nur kombin…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy und Mayan Hein werden vom Sloan Foundation CUNY Summer Research Program (CSURP) unterstützt. Jun Yin wird durch das intramurale Forschungsprogramm der National Institutes of Health Projektnummer 1ZIANS003137 unterstützt. Unterstützt wurde dieses Projekt durch einen PSC-CUNY Award an Ye He und Rinat Abzalimov, der gemeinsam vom Professional Staff Congress und der City University of New York finanziert wurde.
Materials
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) | Millipore Sigma Aldrich | 85707-1G-F | |
| Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5 | Fisher Scientific | NC9464347 | |
| Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
| autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
| Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | AC219095000 | ||
| Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
| Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
| FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
| SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
| Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
| Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |
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