आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग का उपयोग करके ड्रोसोफिला मस्तिष्क में रैपिड लिपिड विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी
Summary
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर डिसोर्प्शन / आयनीकरण (एमएएलडीआई) मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग का उपयोग करके ड्रोसोफिला मस्तिष्क जैसे छोटे ऊतकों में लिपिड और मेटाबोलाइट विश्लेषण के लिए उचित नमूना तैयारी पर विस्तृत मार्गदर्शन प्रदान करना है।
Abstract
लिपिड प्रोफाइलिंग, या लिपिडोमिक्स, एक अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है जिसका उपयोग कोशिका या ऊतक की संपूर्ण लिपिड सामग्री का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। लिपिडोमिक्स से प्राप्त जानकारी विकास, बीमारी और सेलुलर चयापचय में शामिल मार्गों का अध्ययन करने में मूल्यवान है। कई उपकरणों और इंस्ट्रूमेंटेशन ने लिपिडोमिक्स परियोजनाओं की सहायता की है, विशेष रूप से मास स्पेक्ट्रोमेट्री और तरल क्रोमैटोग्राफी तकनीकों के विभिन्न संयोजन। आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग (माल्डी एमएसआई) हाल ही में एक शक्तिशाली इमेजिंग तकनीक के रूप में उभरा है जो पारंपरिक दृष्टिकोणों का पूरक है। यह उपन्यास तकनीक ऊतक डिब्बों के भीतर लिपिड के स्थानिक वितरण पर अद्वितीय जानकारी प्रदान करती है, जो पहले अत्यधिक संशोधनों के उपयोग के बिना अप्राप्य थी। मालदी एमएसआई दृष्टिकोण की नमूना तैयारी महत्वपूर्ण है और इसलिए, इस पत्र का फोकस है। यह पेपर लिपिड विश्लेषण या मेटाबोलाइट और मालदी एमएसआई के माध्यम से छोटे अणु विश्लेषण के लिए छोटे ऊतकों की तैयारी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए इष्टतम काटने के तापमान यौगिक (ओसीटी) में एम्बेडेड बड़ी संख्या में ड्रोसोफिला दिमाग का तेजी से लिपिड विश्लेषण प्रस्तुत करता है।
Introduction
लिपिड जैविक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में शामिल हैं और मोटे तौर पर उनकी संरचनात्मक विविधता के आधार पर पांच श्रेणियों में वर्गीकृत किया जा सकता है: फैटी एसिड, ट्राइसाइलग्लिसरॉल (टीएजी), फॉस्फोलिपिड्स, स्टेरोल लिपिड और स्फिंगोलिपिड्स1. लिपिड के मौलिक कार्य जैविक प्रक्रियाओं (यानी, टीएजी) के लिए ऊर्जा स्रोत प्रदान करना और सेलुलर झिल्ली (यानी, फॉस्फोलिपिड्स और कोलेस्ट्रॉल) बनाना है। हालांकि, विकास और बीमारियों में लिपिड की अतिरिक्त भूमिकाओं का उल्लेख किया गया है, और बायोमेडिकल क्षेत्र में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। उदाहरण के लिए, रिपोर्टों से पता चला है कि विभिन्न लंबाई के फैटी एसिड में अद्वितीय चिकित्सीय भूमिकाएं हो सकती हैं। लघु फैटी एसिड श्रृंखलाएं ऑटोइम्यून बीमारियों के खिलाफ रक्षा तंत्र में शामिल हो सकती हैं, मध्यम लंबाई वाली फैटी एसिड श्रृंखलाएं चयापचयों का उत्पादन करती हैं जो दौरे को कम कर सकती हैं, और लंबी फैटी एसिड श्रृंखलाएं चयापचयों को उत्पन्न करती हैं जिनका उपयोग चयापचय संबंधी विकारों के इलाज के लिए किया जा सकता है2. तंत्रिका तंत्र में, ग्लिया-व्युत्पन्न कोलेस्ट्रॉल और फॉस्फोलिपिड्स को सिनैप्टोजेनेसिस 3,4 के लिए महत्वपूर्ण दिखाया गया है। अन्य प्रकार के लिपिड ने चिकित्सा अनुप्रयोगों में वादा दिखाया है, जिसमें दवा वितरण प्रणालियों में उपयोग किए जाने वाले स्फिंगोलिपिड्स और प्रतिरक्षा प्रणाली 5,6 का समर्थन करने के लिए उपयोग किए जाने वालेसैकरोलिपिड्स शामिल हैं। बायोमेडिकल क्षेत्र में लिपिड की कई भूमिकाओं और संभावित चिकित्सीय अनुप्रयोगों ने लिपिडोमिक्स-सेलुलर लिपिड के मार्गों और इंटरैक्शन का अध्ययन-एक महत्वपूर्ण और तेजी से महत्वपूर्ण क्षेत्र बना दिया है।
लिपिडोमिक्स बड़े पैमाने पर लिपिडोम का अध्ययन करने के लिए विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान का उपयोग करता है। लिपिडोमिक्स में उपयोग की जाने वाली मुख्य प्रयोगात्मक विधियां मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) पर आधारित हैं जो विभिन्न क्रोमैटोग्राफी और आयन-गतिशीलतातकनीक7,8 के साथ मिलकर हैं। क्षेत्र में एमएस का उपयोग इसकी उच्च विशिष्टता और संवेदनशीलता, अधिग्रहण की गति और अद्वितीय क्षमताओं के कारण फायदेमंद है (1) कम और क्षणिक स्तर पर भी होने वाले लिपिड और लिपिड चयापचयों का पता लगाने के लिए, (2) एक ही प्रयोग में सैकड़ों विभिन्न लिपिड यौगिकों का पता लगाएं, (3) पहले अज्ञात लिपिड की पहचान करें, और (4) लिपिड आइसोमर्स के बीच अंतर करें। एमएस में विकास के बीच, जिसमें डिसोर्प्शन इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (डीईएसआई), मालदी और माध्यमिक आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एसआईएमएस) शामिल हैं, मालदी एमएसआई एक शक्तिशाली इमेजिंग तकनीक के रूप में उभरा है जो ऊतक डिब्बों 9,10 के भीतर लिपिड के स्थानिक वितरण पर अद्वितीय जानकारी प्रदान करके पारंपरिक एमएस-आधारित दृष्टिकोणों का पूरक है।
लिपिडोमिक्स के विशिष्ट वर्कफ़्लो में नमूना तैयारी, मास-स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीक का उपयोग करके डेटा अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण11 शामिल हैं। नमूनों में लिपिड और मेटाबोलाइट्स के अध्ययन ने जीवों में चयापचय प्रक्रियाओं की शारीरिक और रोग संबंधी स्थितियों को समझने के लिए तकनीकों का उद्भव किया है। जबकि जैविक बातचीत को समझना महत्वपूर्ण है, लिपिड और चयापचयों की संवेदनशीलता उन्हें रंगों या अन्य संशोधन के बिना छवि और पहचानना मुश्किल बनाती है। मेटाबोलाइट स्तर या वितरण में परिवर्तन से फेनोटाइपिक परिवर्तन हो सकते हैं। चयापचय प्रोफाइलिंग के लिए उपयोग किया जाने वाला एक उपकरण माल्डी एमएसआई है, जो एक लेबल-मुक्त है, सीटू इमेजिंग तकनीक में एक साथ सैकड़ों अणुओं का पता लगाने में सक्षम है। मालदी इमेजिंग उनकी अखंडता और स्थानिक वितरण को संरक्षित करते हुए नमूनों में चयापचयों और लिपिड के दृश्य की अनुमति देता है। लिपिड प्रोफाइलिंग के लिए पिछली तकनीक में लिपिड को व्यक्तिगत रूप से मैप करने के लिए रेडियोधर्मी रसायनों का उपयोग शामिल था, जबकि मालदी इमेजिंग इसे छोड़ देता है और एक साथ लिपिड की एक श्रृंखला का पता लगाने की अनुमति देता है।
लिपिड चयापचय और होमियोस्टेसिस सेल फिजियोलॉजी में महत्वपूर्ण कार्य करते हैं, जैसे कि तंत्रिका तंत्र का रखरखाव और विकास। तंत्रिका तंत्र लिपिड चयापचय का एक आवश्यक पहलू न्यूरॉन्स और ग्लियाल कोशिकाओं के बीच लिपिड शटलिंग है, जो आणविक वाहक लिपोप्रोटीन द्वारा मध्यस्थता की जाती है, जिसमें बहुत कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (वीएलडीएल), कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एलडीएल), और उच्च घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एचडीएल) 12 शामिल हैं। लिपोप्रोटीन में एपोलिपोप्रोटीन (एपीओ) होते हैं, जैसे कि एपीओबी और एपीओडी, जो लिपिड कार्गो के संरचनात्मक ब्लॉक के रूप में और लिपोप्रोटीन रिसेप्टर्स के लिए लिगेंड के रूप में कार्य करते हैं। लिपिड के न्यूरॉन-ग्लिया क्रॉसस्टॉक में ग्लिया-व्युत्पन्न एपीओडी, एपीओई और एपीओजे, और उनके न्यूरोनल एलडीएल रिसेप्टर्स (एलडीएलआर) 13,14 जैसे कई खिलाड़ी शामिल हैं। ड्रोसोफिला में, एपोबोफोरिन, एपीओबी परिवार का एक सदस्य, एक प्रमुख हेमोलिम्फ लिपिड वाहक15 है। एपोलिपोफोरिन में दो निकट से संबंधित लिपोफोरिन रिसेप्टर्स (एलपीआर), एलपीआर 1 और एलपीआर 2 हैं, जो स्तनधारी एलडीएलआर15,16 के होमोलॉग हैं। पिछले अध्ययनों में, एस्ट्रोसाइट-स्रावित लिपोकैलिन ग्लियाल लाज़ारिलो (जीलाज़), मानव एपीओडी के एक ड्रोसोफिला होमोलॉग, और इसके न्यूरोनल रिसेप्टर एलपीआर 1 को न्यूरॉन-ग्लिया लिपिड शटलिंग की सहकारी मध्यस्थता करने के लिए खोजा गया था, इस प्रकार डेंड्राइट मॉर्फोजेनेसिस17 को विनियमित किया गया था। इसलिए, यह अनुमान लगाया गया था कि एलपीआर 1 के नुकसान से ड्रोसोफिला मस्तिष्क में समग्र लिपिड सामग्री में कमी आएगी। मालदी एमएसआई एलपीआर 1−/− उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार के ड्रोसोफिला दिमाग के छोटे ऊतकों में लिपिड सामग्री की रूपरेखा तैयार करने के लिए एक उपयुक्त उपकरण होगा, जैसा कि इस अध्ययन में दिखाया गया है।
मालदी एमएसआई की बढ़ती लोकप्रियता के बावजूद, उपकरण की उच्च लागत और प्रयोगात्मक जटिलता अक्सर व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं में इसके कार्यान्वयन में बाधा डालती है। इस प्रकार, अधिकांश मालदी एमएसआई अध्ययन साझा कोर सुविधाओं का उपयोग करके आयोजित किए जाते हैं। मालदी एमएसआई के अन्य अनुप्रयोगों के साथ, विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए लिपिडोमिक्स के लिए एक सावधानीपूर्वक नमूना तैयारी प्रक्रिया महत्वपूर्ण है। हालांकि, क्योंकि नमूना स्लाइड तैयारी आमतौर पर व्यक्तिगत अनुसंधान प्रयोगशालाओं में की जाती है, मालदी एमएसआई अधिग्रहण में भिन्नता की संभावना है। इसका मुकाबला करने के लिए, इस पत्र का उद्देश्य एक उदाहरण11,17 के रूप में सकारात्मक आयन मोड में वयस्क ड्रोसोफिला दिमाग के एक बड़े समूह के लिपिड विश्लेषण का उपयोग करके मालदी एमएसआई माप से पहले छोटे जैविक नमूनों की नमूना तैयारी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करना है। हालांकि, कुछ फॉस्फोलिपिड वर्गों और अधिकांश छोटे चयापचयों को नकारात्मक आयन मोड में मालदी इमेजिंग द्वारा अनुकूल रूप से पता लगाया जाता है, जिसे पहले11 वर्णित किया गया था। इसलिए, इन दो उदाहरण अध्ययनों के साथ, हम विभिन्न संयोजनों के विस्तृत नमूना तैयारी प्रोटोकॉल प्रदान करने की उम्मीद करते हैं: मुक्त खड़े बड़े ऊतक बनाम एम्बेडेड छोटे ऊतक, पिघलना-बढ़ते बनाम गर्म-स्लाइड बढ़ते, और सकारात्मक आयन मोड बनाम नकारात्मक आयन मोड।
Protocol
Representative Results
Discussion
जैसा कि उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार के ड्रोसोफिला दिमाग में लिपिड संरचना में भिन्नता पर अध्ययन में दिखाया गया है, मालदी एमएसआई छोटे कीड़ों के अंगों के भीतर आणविक वितरण पैटर्न के सीटू विश्लेषण ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
युकी एक्स चेन, केली वीरसामी और माया हेन स्लोअन फाउंडेशन सीयूएनवाई समर रिसर्च प्रोग्राम (सीएसयूआरपी) द्वारा समर्थित हैं। जून यिन को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ प्रोजेक्ट नंबर 1ZIANS003137 के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया है। इस परियोजना के लिए सहायता ये हे और रिनत अबजालिमोव को पीएससी-सीयूएनवाई पुरस्कार द्वारा प्रदान की गई थी, जो संयुक्त रूप से प्रोफेशनल स्टाफ कांग्रेस और सिटी यूनिवर्सिटी ऑफ न्यूयॉर्क द्वारा वित्त पोषित थी।
Materials
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) | Millipore Sigma Aldrich | 85707-1G-F | |
| Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5 | Fisher Scientific | NC9464347 | |
| Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
| autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
| Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | AC219095000 | ||
| Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
| Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
| FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
| SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
| Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
| Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |
References
- Park, J., et al. Bioactive lipids and their derivatives in biomedical applications. Biomolecules & Therapeutics. 29 (5), 465-482 (2021).
- Augustin, K., et al. Mechanisms of action for the medium-chain triglyceride ketogenic diet in neurological and metabolic disorders. Lancet Neurology. 17 (1), 84-93 (2018).
- Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
- Mauch, D. H., et al. Cns synaptogenesis promoted by glia-derived cholesterol. Science. 294 (5545), 1354-1357 (2001).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
- Zhou, F., Ciric, B., Zhang, G. X., Rostami, A. Immunotherapy using lipopolysaccharide-stimulated bone marrow-derived dendritic cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis. Clinical and Experimental Immunology. 178 (3), 447-458 (2014).
- Carrasco-Pancorbo, A., Navas-Iglesias, N., Cuadros-Rodriguez, L. From lipid analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part I: Modern lipid analysis. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (3), 263-278 (2009).
- Navas-Iglesias, N., Carrasco-Pancorbo, A., Cuadros-Rodriguez, L. From lipids analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part II: Analytical lipidomics. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (4), 393-403 (2009).
- Yang, K., Han, X. Lipidomics: Techniques, applications, and outcomes related to biomedical sciences. Trends in Biochemical Sciences. 41 (11), 954-969 (2016).
- Norris, J. L., Caprioli, R. M. Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research. Chemical Reviews. 113 (4), 2309-2342 (2013).
- Veerasammy, K., et al. Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging. Journal of Visualized Experiments. (166), e62008 (2020).
- Tracey, T. J., Steyn, F. J., Wolvetang, E. J., Ngo, S. T. Neuronal lipid metabolism: Multiple pathways driving functional outcomes in health and disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 10 (2018).
- Jackson, C. L., Walch, L., Verbavatz, J. M. Lipids and their trafficking: An integral part of cellular organization. Developmental Cell. 39 (2), 139-153 (2016).
- Wang, H., Eckel, R. H. What are lipoproteins doing in the brain. Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (1), 8-14 (2014).
- Palm, W., et al. Lipoproteins in Drosophila melanogaster-Assembly, function, and influence on tissue lipid composition. PLoS Genetics. 8 (7), 1002828 (2012).
- Parra-Peralbo, E., Culi, J. Drosophila lipophorin receptors mediate the uptake of neutral lipids in oocytes and imaginal disc cells by an endocytosis-independent mechanism. PLoS Genetics. 7 (2), 1001297 (2011).
- Yin, J., et al. Brain-specific lipoprotein receptors interact with astrocyte derived apolipoprotein and mediate neuron-glia lipid shuttling. Nature Communications. 12 (1), 2408 (2021).
- Tuthill, B. F., Searcy, L. A., Yost, R. A., Musselman, L. P. Tissue-specific analysis of lipid species in Drosophila during overnutrition by UHPLC-MS/MS and MALDI-MSI. Journal of Lipid Research. 61 (3), 275-290 (2020).
- Kaya, I., Jennische, E., Lange, S., Malmberg, P. Multimodal chemical imaging of a single brain tissue section using ToF-SIMS, MALDI-ToF and immuno/histochemical staining. Analyst. 146 (4), 1169-1177 (2021).
- Phan, N. T., Fletcher, J. S., Ewing, A. G. Lipid structural effects of oral administration of methylphenidate in Drosophila brain by secondary ion mass spectrometry imaging. Analytical Chemistry. 87 (8), 4063-4071 (2015).
- Dienel, G. A. Metabolomic and imaging mass spectrometric assays of labile brain metabolites: Critical importance of brain harvest procedures. Neurochemical Research. 45 (11), 2586-2606 (2020).
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: Practical aspects of sample preparation. Journal of Mass Spectrometry. 38 (7), 699-708 (2003).
- Phan, N. T., Mohammadi, A. S., Dowlatshahi Pour, M., Ewing, A. G. Laser desorption ionization mass spectrometry imaging of Drosophila brain using matrix sublimation versus modification with nanoparticles. Analytical Chemistry. 88 (3), 1734-1741 (2016).
- Niehoff, A. C., et al. Analysis of Drosophila lipids by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging. Analytical Chemistry. 86 (22), 11086-11092 (2014).
- Enomoto, Y., Nt An, P., Yamaguchi, M., Fukusaki, E., Shimma, S. Mass spectrometric imaging of GABA in the Drosophila melanogaster adult head. Analytical Sciences. 34 (9), 1055-1059 (2018).
- Yang, E., Gamberi, C., Chaurand, P. Mapping the fly malpighian tubule lipidome by imaging mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 54 (6), 557-566 (2019).
- Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. Advances in mass spectrometry for lipidomics. Annual Review of Analytical Chemistry. 3, 433-465 (2010).
- Han, X. Lipidomics for studying metabolism. Nature Reviews Endocrinology. 12 (11), 668-679 (2016).
- Wang, M., Wang, C., Han, X. Selection of internal standards for accurate quantification of complex lipid species in biological extracts by electrospray ionization mass spectrometry-What, how and why. Mass Spectrometry Reviews. 36 (6), 693-714 (2017).
