Matris Destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon Kütle Spektrometrisi Görüntüleme Kullanarak Drosophila Beyinde Hızlı Lipid Analizi için Örnek Hazırlama
Summary
Bu protokolün amacı, matris yardımlı lazer desorpsiyon / iyonizasyon (MALDI) kütle spektrometrisi görüntülemesini kullanarak Drosophila beyni gibi küçük dokularda lipit ve metabolit analizi için uygun numune hazırlama konusunda ayrıntılı rehberlik sağlamaktır.
Abstract
Lipid profillemesi veya lipidomik, bir hücrenin veya dokunun tüm lipit içeriğini incelemek için kullanılan köklü bir tekniktir. Lipidomiklerden elde edilen bilgiler, gelişim, hastalık ve hücresel metabolizmada yer alan yolakların incelenmesinde değerlidir. Birçok alet ve enstrümantasyon, lipidomik projelere, özellikle de kütle spektrometresi ve sıvı kromatografisi tekniklerinin çeşitli kombinasyonlarına yardımcı olmuştur. Matriks yardımlı lazer desorpsiyon/iyonizasyon kütle spektrometrisi görüntüleme (MALDI MSI) son zamanlarda geleneksel yaklaşımları tamamlayan güçlü bir görüntüleme tekniği olarak ortaya çıkmıştır. Bu yeni teknik, lipitlerin doku bölmeleri içindeki uzamsal dağılımı hakkında benzersiz bilgiler sağlar, bu da daha önce aşırı modifikasyonlar kullanılmadan elde edilemezdi. MALDI MSI yaklaşımının örnek hazırlanması kritiktir ve bu nedenle bu makalenin odak noktasıdır. Bu yazıda, MALDI MSI aracılığıyla lipid analizi veya metabolit ve küçük molekül analizi için küçük dokuların hazırlanması için ayrıntılı bir protokol sağlamak üzere optimal kesme sıcaklığı bileşiğine (OCT) gömülü çok sayıda Drosophila beyninin hızlı bir lipit analizi sunulmaktadır.
Introduction
Lipitler çok çeşitli biyolojik süreçlerde yer alır ve yapısal çeşitliliklerine göre beş kategoriye ayrılabilir: yağ asitleri, triasilgliseroller (TAG’ler), fosfolipitler, sterol lipitler ve sfengolipidler1. Lipitlerin temel işlevleri, biyolojik süreçler (yani TAG’ler) için enerji kaynakları sağlamak ve hücresel membranlar (yani fosfolipitler ve kolesterol) oluşturmaktır. Bununla birlikte, lipitlerin ek rolleri gelişim ve hastalıklarda kaydedilmiştir ve biyomedikal alanda kapsamlı bir şekilde çalışılmıştır. Örneğin, raporlar farklı uzunluklardaki yağ asitlerinin benzersiz terapötik rollere sahip olabileceğini göstermiştir. Kısa yağ asidi zincirleri otoimmün hastalıklara karşı savunma mekanizmalarında rol oynayabilir, orta uzunluktaki yağ asidi zincirleri nöbetleri hafifletebilecek metabolitler üretir ve uzun yağ asidi zincirleri metabolik bozuklukların tedavisinde kullanılabilecek metabolitler üretir2. Sinir sisteminde, glia kaynaklı kolesterol ve fosfolipitlerin sinaptogenez için hayati önem taşıdığı gösterilmiştir 3,4. İlaç dağıtım sistemlerinde kullanılan sfengolipidler ve bağışıklık sistemini desteklemek için kullanılan sakarolipidler de dahil olmak üzere diğer lipit türleri tıbbi uygulamalarda umut vaat etmiştir 5,6. Biyomedikal alanda lipitlerin sayısız rolü ve potansiyel terapötik uygulamaları, lipidomikleri – hücresel lipitlerin yollarının ve etkileşimlerinin incelenmesi – kritik ve giderek daha önemli bir alan haline getirmiştir.
Lipidomics, lipidomu büyük ölçekte incelemek için analitik kimyadan yararlanır. Lipidomikte kullanılan başlıca deneysel yöntemler, çeşitli kromatografi ve iyon hareketlilik teknikleri ile birlikte kütle spektrometrisine (MS) dayanmaktadır 7,8. MS’in bölgede kullanımı, yüksek özgüllüğü ve duyarlılığı, edinme hızı ve (1) düşük ve geçici seviyelerde bile meydana gelen lipitleri ve lipit metabolitlerini tespit etme, (2) tek bir deneyde yüzlerce farklı lipit bileşiğini tespit etme, (3) daha önce bilinmeyen lipitleri tanımlama ve (4) lipit izomerleri arasında ayrım yapma konusundaki benzersiz yetenekleri nedeniyle avantajlıdır. Desorpsiyon elektrosprey iyonizasyonu (DESI), MALDI ve sekonder iyon kütle spektrometresi (SIMS) DAHIL OLMAK ÜZERE MS’DEKI GELIŞMELER ARASıNDA MALDI MSI, lipitlerin doku bölmeleri içindeki uzamsal dağılımı hakkında benzersiz bilgiler sağlayarak geleneksel MS tabanlı yaklaşımları tamamlayan güçlü bir görüntüleme tekniği olarak ortaya çıkmıştır 9,10.
Lipidomiklerin tipik iş akışı, numune hazırlama, kütle spektrometresi teknolojisi kullanılarak veri toplama ve veri analizinden oluşur11. Örneklerde lipitlerin ve metabolitlerin incelenmesi, organizmalardaki metabolik süreçlerin fizyolojik ve patolojik koşullarını anlamak için tekniklerin ortaya çıkmasına neden olmuştur. Biyolojik etkileşimleri anlamak önemli olsa da, lipitlerin ve metabolitlerin duyarlılığı, boyalar veya başka modifikasyonlar olmadan görüntülenmesini ve tanımlanmasını zorlaştırır. Metabolit düzeylerindeki veya dağılımındaki değişiklikler fenotipik değişikliklere yol açabilir. Metabolomik profilleme için kullanılan araçlardan biri, yüzlerce molekülü aynı anda tespit edebilen etiketsiz, yerinde bir görüntüleme tekniği olan MALDI MSI’dır . MALDI görüntüleme, örneklerdeki metabolitlerin ve lipitlerin görselleştirilmesine izin verirken, bütünlüklerini ve uzamsal dağılımlarını korur. Lipid profillemesi için önceki teknoloji, lipitleri ayrı ayrı haritalamak için radyoaktif kimyasalların kullanılmasını içerirken, MALDI görüntüleme bundan vazgeçer ve aynı anda bir dizi lipitin tespit edilmesine izin verir.
Lipid metabolizması ve homeostaz, sinir sisteminin korunması ve geliştirilmesi gibi hücre fizyolojisinde önemli işlevler oynar. Sinir sistemi lipid metabolizmasının önemli bir yönü, nöronlar ve glial hücreler arasındaki lipit titremesidir; bu, çok düşük yoğunluklu lipoprotein (VLDL), düşük yoğunluklu lipoproteinler (LDL) ve yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL) dahil olmak üzere moleküler taşıyıcı lipoproteinler tarafından aracılık edilir12. Lipoproteinler, lipid kargosunun yapısal blokları ve lipoprotein reseptörleri için ligandlar olarak işlev gören ApoB ve ApoD gibi apolipoproteinler (Apo) içerir. Lipitlerin nöron-glia çaprazlaması, glia kaynaklı ApoD, ApoE ve ApoJ gibi çoklu oyuncuları ve bunların nöronal LDL reseptörlerini (LDLR’ler) içerir13,14. Drosophila’da, ApoB ailesinin bir üyesi olan apolipoforin, majör bir hemolenf lipid taşıyıcısıdır15. Apolipoforin, memeli LDLR 15,16’nın homologları olan iki yakından ilişkili lipoforin reseptörüne (LpR), LpR1 ve LpR2’ye sahiptir. Önceki çalışmalarda, insan ApoD’sinin bir Drosophila homologu olan astrosit salgılanan lipokalin Glial Lazarillo (GLaz) ve nöronal reseptörü LpR1’in, nöron-glia lipit sürünmesine işbirliği içinde aracılık ettiği ve böylece dendrit morfogenezi17’yi düzenlediği keşfedildi. Bu nedenle, LpR1 kaybının Drosophila beynindeki genel lipit içeriğinde bir azalmaya neden olacağı tahmin edilmektedir. MALDI MSI, bu çalışmada gösterildiği gibi, LpR1-/-mutant ve vahşi tip Drosophila beyinlerinin küçük dokularındaki lipit içeriğinin profilini çıkarmak için uygun bir araç olacaktır.
MALDI MSI’ın artan popülaritesine rağmen, cihazın yüksek maliyeti ve deneysel karmaşıklığı genellikle bireysel laboratuvarlarda uygulanmasını engellemektedir. Bu nedenle, çoğu MALDI MSI çalışması paylaşılan çekirdek tesisler kullanılarak yürütülmektedir. MALDI MSI’ın diğer uygulamalarında olduğu gibi, lipidomikler için dikkatli bir numune hazırlama süreci, güvenilir sonuçlar elde etmek için kritik öneme sahiptir. Bununla birlikte, numune slayt hazırlama tipik olarak bireysel araştırma laboratuvarlarında gerçekleştirildiğinden, MALDI MSI ediniminde farklılık olasılığı vardır. Bununla mücadele etmek için, bu makale, örnek olarak pozitif iyon modunda büyük bir yetişkin Drosophila beyni grubunun lipit analizini kullanarak MALDI MSI ölçümünden önce küçük biyolojik örneklerin numune hazırlanması için ayrıntılı bir protokol sağlamayı amaçlamaktadır11,17. Bununla birlikte, bazı fosfolipid sınıfları ve küçük metabolitlerin çoğunluğu, daha önce11 olarak tanımlanan negatif iyon modunda MALDI görüntüleme ile olumlu bir şekilde tespit edilir. Bu nedenle, bu iki örnek çalışma ile, çeşitli kombinasyonların ayrıntılı numune hazırlama protokollerini sağlamayı umuyoruz: gömülü küçük dokuya karşı serbest duran büyük doku, çözülme montajına karşı sıcak slayt montajı ve negatif iyon moduna karşı pozitif iyon modu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mutant ve vahşi tip Drosophila beyinlerindeki lipit kompozisyonundaki varyasyonlar üzerine yapılan çalışmada gösterildiği gibi, MALDI MSI, küçük böceklerin organlarındaki moleküler dağılım modellerinin yerinde analizi için değerli bir etiketsiz görüntüleme tekniği olabilir. Gerçekten de, lipitler Drosophila kafalarının hem beyin dokusunda hem de yağ gövdelerinde dağıldığından, sıvı kromatografisi ve kütle-spektrometriye (LC-MS) dayanan geleneksel lipidomik ya…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy ve Maya Hein, Sloan Vakfı CUNY Yaz Araştırma Programı (CSURP) tarafından desteklenmektedir. Jun Yin, Ulusal Sağlık Enstitüleri Projesi Numarası 1ZIANS003137’nin intramural araştırma programı tarafından desteklenmektedir. Bu projeye destek, Profesyonel Personel Kongresi ve New York Şehir Üniversitesi tarafından ortaklaşa finanse edilen Ye He ve Rinat Abzalimov’a PSC-CUNY Ödülü ile sağlandı.
Materials
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) | Millipore Sigma Aldrich | 85707-1G-F | |
| Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5 | Fisher Scientific | NC9464347 | |
| Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
| autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
| Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | AC219095000 | ||
| Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
| Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
| FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
| SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
| Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
| Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |
References
- Park, J., et al. Bioactive lipids and their derivatives in biomedical applications. Biomolecules & Therapeutics. 29 (5), 465-482 (2021).
- Augustin, K., et al. Mechanisms of action for the medium-chain triglyceride ketogenic diet in neurological and metabolic disorders. Lancet Neurology. 17 (1), 84-93 (2018).
- Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
- Mauch, D. H., et al. Cns synaptogenesis promoted by glia-derived cholesterol. Science. 294 (5545), 1354-1357 (2001).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
- Zhou, F., Ciric, B., Zhang, G. X., Rostami, A. Immunotherapy using lipopolysaccharide-stimulated bone marrow-derived dendritic cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis. Clinical and Experimental Immunology. 178 (3), 447-458 (2014).
- Carrasco-Pancorbo, A., Navas-Iglesias, N., Cuadros-Rodriguez, L. From lipid analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part I: Modern lipid analysis. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (3), 263-278 (2009).
- Navas-Iglesias, N., Carrasco-Pancorbo, A., Cuadros-Rodriguez, L. From lipids analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part II: Analytical lipidomics. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (4), 393-403 (2009).
- Yang, K., Han, X. Lipidomics: Techniques, applications, and outcomes related to biomedical sciences. Trends in Biochemical Sciences. 41 (11), 954-969 (2016).
- Norris, J. L., Caprioli, R. M. Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research. Chemical Reviews. 113 (4), 2309-2342 (2013).
- Veerasammy, K., et al. Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging. Journal of Visualized Experiments. (166), e62008 (2020).
- Tracey, T. J., Steyn, F. J., Wolvetang, E. J., Ngo, S. T. Neuronal lipid metabolism: Multiple pathways driving functional outcomes in health and disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 10 (2018).
- Jackson, C. L., Walch, L., Verbavatz, J. M. Lipids and their trafficking: An integral part of cellular organization. Developmental Cell. 39 (2), 139-153 (2016).
- Wang, H., Eckel, R. H. What are lipoproteins doing in the brain. Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (1), 8-14 (2014).
- Palm, W., et al. Lipoproteins in Drosophila melanogaster-Assembly, function, and influence on tissue lipid composition. PLoS Genetics. 8 (7), 1002828 (2012).
- Parra-Peralbo, E., Culi, J. Drosophila lipophorin receptors mediate the uptake of neutral lipids in oocytes and imaginal disc cells by an endocytosis-independent mechanism. PLoS Genetics. 7 (2), 1001297 (2011).
- Yin, J., et al. Brain-specific lipoprotein receptors interact with astrocyte derived apolipoprotein and mediate neuron-glia lipid shuttling. Nature Communications. 12 (1), 2408 (2021).
- Tuthill, B. F., Searcy, L. A., Yost, R. A., Musselman, L. P. Tissue-specific analysis of lipid species in Drosophila during overnutrition by UHPLC-MS/MS and MALDI-MSI. Journal of Lipid Research. 61 (3), 275-290 (2020).
- Kaya, I., Jennische, E., Lange, S., Malmberg, P. Multimodal chemical imaging of a single brain tissue section using ToF-SIMS, MALDI-ToF and immuno/histochemical staining. Analyst. 146 (4), 1169-1177 (2021).
- Phan, N. T., Fletcher, J. S., Ewing, A. G. Lipid structural effects of oral administration of methylphenidate in Drosophila brain by secondary ion mass spectrometry imaging. Analytical Chemistry. 87 (8), 4063-4071 (2015).
- Dienel, G. A. Metabolomic and imaging mass spectrometric assays of labile brain metabolites: Critical importance of brain harvest procedures. Neurochemical Research. 45 (11), 2586-2606 (2020).
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: Practical aspects of sample preparation. Journal of Mass Spectrometry. 38 (7), 699-708 (2003).
- Phan, N. T., Mohammadi, A. S., Dowlatshahi Pour, M., Ewing, A. G. Laser desorption ionization mass spectrometry imaging of Drosophila brain using matrix sublimation versus modification with nanoparticles. Analytical Chemistry. 88 (3), 1734-1741 (2016).
- Niehoff, A. C., et al. Analysis of Drosophila lipids by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging. Analytical Chemistry. 86 (22), 11086-11092 (2014).
- Enomoto, Y., Nt An, P., Yamaguchi, M., Fukusaki, E., Shimma, S. Mass spectrometric imaging of GABA in the Drosophila melanogaster adult head. Analytical Sciences. 34 (9), 1055-1059 (2018).
- Yang, E., Gamberi, C., Chaurand, P. Mapping the fly malpighian tubule lipidome by imaging mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 54 (6), 557-566 (2019).
- Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. Advances in mass spectrometry for lipidomics. Annual Review of Analytical Chemistry. 3, 433-465 (2010).
- Han, X. Lipidomics for studying metabolism. Nature Reviews Endocrinology. 12 (11), 668-679 (2016).
- Wang, M., Wang, C., Han, X. Selection of internal standards for accurate quantification of complex lipid species in biological extracts by electrospray ionization mass spectrometry-What, how and why. Mass Spectrometry Reviews. 36 (6), 693-714 (2017).
