जलजनित एंटीबायोटिक प्रतिरोधी बैक्टीरिया का अलगाव और पहचान और उनके एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन के आणविक लक्षण वर्णन
Summary
यहां, हम पानी से एंटीबायोटिक प्रतिरोधी बैक्टीरिया के अलगाव और पहचान और उनके एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन (एआरजी) के आणविक लक्षण वर्णन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। संस्कृति-आधारित और गैर-संस्कृति-आधारित (मेटाजेनोमिक विश्लेषण) तकनीकों का उपयोग कुल जीवाणु विविधता और मुंबई, भारत से ताजे पानी में मौजूद विभिन्न एआरजी के कुल पूल के बारे में पूरी जानकारी प्रदान करता है।
Abstract
मीठे पानी के निकायों से जुड़े माइक्रोबायोटा के माध्यम से एंटीबायोटिक प्रतिरोध (एआर) का विकास और प्रसार एक प्रमुख वैश्विक स्वास्थ्य चिंता है। वर्तमान अध्ययन में, ताजे पानी के नमूने एकत्र किए गए थे और पारंपरिक संस्कृति-आधारित तकनीकों और एक उच्च-थ्रूपुट संस्कृति-स्वतंत्र मेटाजेनोमिक दृष्टिकोण दोनों का उपयोग करके कुल जीवाणु विविधता और एआर जीन (एआरजी) के संबंध में विश्लेषण किया गया था। यह पेपर मीठे पानी के नमूनों से कुल और एंटीबायोटिक प्रतिरोधी कल्चरेबल बैक्टीरिया की गणना और खेती योग्य आइसोलेट्स में फेनोटाइपिक और जीनोटाइपिक प्रतिरोध के निर्धारण के लिए एक व्यवस्थित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इसके अलावा, हम गैर-संवर्धन योग्य बैक्टीरिया सहित समग्र जीवाणु विविधता की पहचान के लिए ताजे पानी के नमूने से निकाले गए कुल मेटाजेनोमिक डीएनए के पूरे मेटाजेनोमिक विश्लेषण के उपयोग की रिपोर्ट करते हैं, और जल निकाय में विभिन्न एआरजी (रेसिस्टोम) के कुल पूल की पहचान करते हैं। इन विस्तृत प्रोटोकॉल के बाद, हमने 9.6 × 10 5-1.2 × 109 सीएफयू / एमएल की सीमा में एक उच्च एंटीबायोटिक प्रतिरोधी बैक्टीरिया लोड देखा। अधिकांश आइसोलेट्स कई परीक्षण किए गए एंटीबायोटिक दवाओं के लिए प्रतिरोधी थे, जिनमें सेफोटैक्सिम, एम्पीसिलिन, लिवोफ़्लॉक्सासिन, क्लोरैम्फेनिकॉल, सेफ्ट्रिएक्सोन, जेंटामाइसिन, नियोमाइसिन, ट्राइमेथोप्रिम और सिप्रोफ्लोक्सासिन शामिल थे, जिसमें ≥0.2 के कई एंटीबायोटिक प्रतिरोध (एमएआर) इंडेक्स थे, जो आइसोलेट्स में प्रतिरोध के उच्च स्तर का संकेत देते हैं। 16 एस आरआरएनए अनुक्रमण ने संभावित मानव रोगजनकों की पहचान की, जैसे कि क्लेबसिएला निमोनिया, और अवसरवादी बैक्टीरिया, जैसे कि कोमामोनास एसपीपी, माइक्रोकोकस एसपीपी, आर्थ्रोबैक्टर एसपीपी, और एरोमोनास एसपीपी। आइसोलेट्स के आणविक लक्षण वर्णन ने विभिन्न एआरजी की उपस्थिति दिखाई, जैसे कि ब्लाटेम, ब्लासीटीएक्स-एम (β-लैक्टम), एएडीए, एएसी (6′)-आईबी (एमिनोग्लाइकोसाइड), और डीएफआर 1 (ट्राइमेथोप्रिम्स), जिसकी पुष्टि पूरे मेटाजीनोमिक डीएनए विश्लेषण द्वारा भी की गई थी। मेटाजीनोमिक डीएनए में एंटीबायोटिक एफ्लक्स पंप-एमटीआरए, मैकबी, एमडीटीए, एसीआरडी, β-लैक्टामेस-एसएमबी -1, वीआईएम -20, सीसीआरए, एएमपीसी, बीएलएजेड, क्लोरैम्फेनिकॉल एसिटाइलट्रांसफेरेज़ जीन कैटबी 10, और रिफैम्पिसिन प्रतिरोध जीन आरपीएचबी के लिए एन्कोडिंग के उच्च प्रसार का भी पता चला था। इस अध्ययन में चर्चा किए गए प्रोटोकॉल की मदद से, हमने विविध एआर फेनोटाइपिक और जीनोटाइपिक लक्षणों के साथ जलजनित एमएआर बैक्टीरिया की उपस्थिति की पुष्टि की। इस प्रकार, पूरे मेटाजेनोमिक डीएनए विश्लेषण का उपयोग जल निकाय की समग्र एआर स्थिति निर्धारित करने के लिए पारंपरिक संस्कृति-आधारित तकनीकों के पूरक तकनीक के रूप में किया जा सकता है।
Introduction
रोगाणुरोधी प्रतिरोध (एएमआर) को सबसे अधिक दबाव वाली वैश्विक समस्याओं में से एक के रूप में पहचाना गया है। एएमआर का तेजी से विकास और इसका विश्वव्यापी प्रसार मानव स्वास्थ्यऔर वैश्विक अर्थव्यवस्था के लिए सबसे बड़े खतरों में से एक है। एंटीबायोटिक दवाओं के अति प्रयोग और दुरुपयोग से एआर में वृद्धि हुई है। यह कोविड-19 महामारी द्वारा उजागर किया गया है, जिसके दौरान कई मामलों में संबंधित माध्यमिक संक्रमणों के उपचार सेप्रभावित रोगियों में एएमआर के कारण भारी समझौता किया गया था। मनुष्यों द्वारा एंटीबायोटिक दवाओं के प्रत्यक्ष उपयोग/दुरुपयोग के अलावा, कृषि और पशुपालन में एंटीबायोटिक दवाओं का अति प्रयोग और दुरुपयोग और जल निकायों सहित पर्यावरण में उनका अनुचित निर्वहन एकप्रमुख चिंता का विषय है। बैक्टीरिया में नए प्रतिरोध लक्षणों और मल्टीड्रग प्रतिरोध का उदय तत्काल एआर के विकास और इसके प्रसार के लिए अग्रणी कारकों की बेहतर समझ की आवश्यकता पर प्रकाश डालता है। कई एंटीबायोटिक-प्रतिरोधी बैक्टीरिया, जो अक्सर प्लास्मिड जैसे मोबाइल आनुवंशिक तत्वों पर कई एआर जीन (एआरजी) ले जाते हैं, इन प्रतिरोध जीनों को गैर-प्रतिरोधी सूक्ष्मजीवों में स्थानांतरित कर सकते हैं, जिसमें संभावित मानव रोगजनक भी शामिल हैं, इस प्रकार सुपरबग्स का उद्भव होता है जो अंतिम-उपाय एंटीबायोटिक दवाओं के साथ भी इलाज योग्य नहींहैं। ये कई एंटीबायोटिक प्रतिरोधी बैक्टीरिया, यदि पानी के पारिस्थितिक तंत्र में मौजूद हैं, तो मछली, केकड़ों और मोलस्क जैसे दूषित पानी आधारित खाद्य पदार्थों की खपत के माध्यम से सीधे मानव आंत में प्रवेश कर सकते हैं। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि स्वाभाविक रूप से होने वाली जल प्रणालियों में एआर बैक्टीरिया का प्रसार पीने के पानी सहित अन्य पानी की आपूर्ति तक भी पहुंच सकता है, और इस प्रकार, मानव खाद्य श्रृंखला 5,6,7 में प्रवेश कर सकता है।
वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य मुंबई, भारत में एक जल निकाय में मौजूद कुल जीवाणु विविधता और विभिन्न एआरजी के कुल पूल के बारे में पूरी जानकारी प्राप्त करने के लिए संस्कृति-आधारित और गैर-संस्कृति-आधारित (संपूर्ण मेटाजेनोमिक विश्लेषण) तकनीकों के संयोजन का उपयोग करके एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रदान करना है। परंपरागत रूप से, जल निकायों में जीवाणु विविधता का अध्ययन करने के लिए संस्कृति-आधारित तकनीकों का उपयोग किया गया है। चूंकि खेती योग्य सूक्ष्मजीव किसी भी आला में कुल माइक्रोबायोटा का केवल एक छोटा प्रतिशत बनाते हैं, जीवाणु विविधता की समग्र स्थिति और किसी भी नमूने में प्रचलित विभिन्न प्रतिरोधी लक्षणों की बेहतर समझ रखने के लिए, विभिन्न संस्कृति-आधारित और संस्कृति-स्वतंत्र तकनीकों का उपयोग किया जाना चाहिए। ऐसी एक मजबूत और विश्वसनीय संस्कृति-स्वतंत्र तकनीक संपूर्ण मेटाजेनोमिक डीएनए विश्लेषण है। इस उच्च-थ्रूपुट विधि का उपयोग बैक्टीरिया विविधता या विभिन्न एआरजी 8,9 के कार्यात्मक एनोटेशन पर विभिन्न अध्ययनों में सफलतापूर्वक किया गया है। यह तकनीक विभिन्न विश्लेषणों के लिए प्रारंभिक सामग्री के रूप में मेटाजीनोम (एक नमूने में कुल आनुवंशिक सामग्री) का उपयोग करती है और इसलिए, संस्कृति-स्वतंत्र है। वर्तमान अध्ययन में प्रोटोकॉल का उपयोग पूरे मेटाजीनोमिक डीएनए विश्लेषण के लिए किया जा सकता है ताकि पानी के नमूनों में कुल जीवाणु विविधता और विभिन्न एआरजी (रेसिस्टोम) के बारे में जानकारी प्राप्त की जा सके।
Protocol
Representative Results
Discussion
नमूना संग्रह और प्रसंस्करण एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और अध्ययन के परिणामों और व्याख्या को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए, नमूनों में परिवर्तनशीलता का पता लगाने के लिए, अध्ययन किए जा रहे मीठे पानी क…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को आंशिक रूप से मुंबई विश्वविद्यालय के विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग-विश्वविद्यालय अनुसंधान और वैज्ञानिक उत्कृष्टता संवर्धन (डीएसटी-पर्स) योजना से वित्तीय अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। देविका घड़ीगांवकर ने इस योजना के तहत प्रोजेक्ट फेलो के रूप में काम किया। विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग-विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान बोर्ड (डीएसटी-एसईआरबी) परियोजना संख्या: सीआरजी/2018/003624 के तहत वरिष्ठ रिसर्च फेलो हर्षाली शिंदे द्वारा प्रदान की गई तकनीकी सहायता को स्वीकार किया जाता है।
Materials
| 100 bp DNA ladder | Himedia | MBT049-50LN | For estimation of size of the amplicons |
| 2x PCR Taq mastermix | HiMedia | MBT061-50R | For making PCR reaction mixture |
| 37 °C Incubator | GS-192, Gayatri Scientific | NA | For incubation of bacteria |
| 6x Gel Loading Buffer | HiMedia | ML015-1ML | Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis |
| Agarose powder | Himedia | MB229-50G | For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Ampicillin antibiotic disc | HiMedia | SD002 | For performing AST |
| Autoclave | Equitron | NA | Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | NA | To check the quality and quantity of the amplified library |
| Bisafety B2 Cabinet | IMSET | IMSET BSC-Class II Type B2 | Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc. |
| Cefotaxime antibiotic disc | HiMedia | SD295E-5VL | For performing AST |
| Cefotaxime antibiotic powder | HiMedia | TC352-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Ceftriaxone antibiotic disc | HiMedia | SD065 | For performing AST |
| Centrifuge Minispin | Eppendorf | Minispin Plus-5453 | Used to pellet the debris during crude DNA preparation |
| Chloramphenicol antibiotic disc | HiMedia | SD006-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD060-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic powder | HiMedia | TC447-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Colorimeter | Quest | NA | For checking the OD of culture suspensions |
| Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database | functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/ | ||
| Cooling Shaker Incubator | BTL41 Allied Scientific | NA | For incubation of media plates for culturing bacteria |
| Deep Freezer (-40 °C) | Haier | DW40L, Haier Biomedicals | For storage of glycerol stocks |
| DNA Library Prep Kit | NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NA | Paired-end sequencing library preparation |
| EDTA | HiMedia | GRM1195-100G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Electrophoresis Apparatus | TechResource | 15 cm gel casting tray | For making the agarose gel and carrying out electrophoresis |
| Electrophoresis Power pack with electrodes | Genei | NA | For running the AGE |
| Erythromycin antibiotic disc | HiMedia | SD222-5VL | For performing AST |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | CMS528-1G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | TC024-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Escherichia coli ATCC 25922 | HiMedia | 0335X-1 | Used as a control while performing AST |
| Ethidium Bromide | HiMedia | MB071-1G | Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System |
| Fluorometer | Qubit 2.0 | NA | For determining concentration of extracted metagenomic DNA |
| Gel Documentation System | BioRad | Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis | |
| Gentamicin antibiotic disc | HiMedia | SD170-5x50DS | For performing AST |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS119-500ML | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Glycerol | HiMedia | GRM1027-500ML | For making glycerol stocks |
| Imipenem antibiotic disc | HiMedia | SD073 | For performing AST |
| Kaiju Database | NA | NA | For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/ |
| Kanamycin antibiotic disc | HiMedia | SD017-5x50DS | For performing AST |
| Kanamycin antibiotic powder | HiMedia | MB105-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Levofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD216-5VL | For performing AST |
| Luria Bertani broth | Himedia | M1245-500G | For enrichment of cultures |
| McFarland Standards | Himedia | R092-1No | To compare density of culture suspension |
| Molecular Biology water | HiMedia | TCL018-500ML | For making PCR reaction mixture |
| Mueller-Hinton Agar (MHA) | HiMedia | M173-500G | For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST) |
| Neomycin antibiotic disc | HiMedia | SD731-5x50DS | For performing AST |
| PCR Gradient Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz | Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes |
| Primers | Xcelris | NA | For PCR amplication |
| R2A Agar, Modified | HiMedia | M1743 | For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load |
| Scaffold generation | CLC Genomics Workbench 6.0 | NA | For generation of scaffolds |
| Sequencer | Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) | NA | Sequencing of amplified library |
| Sodium Chloride | HiMedia | TC046-500G | For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample |
| Soil DNA isolation Kit | Xcelgen | NA | For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 | HiMedia | 0365P | Used as a control while performing AST |
| Taxonomical Classification | Kaiju ioinformatics tool | NA | For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level |
| The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) | NA | NA | For functional annotation of ARGs |
| Tigecycline antibiotic disc | HiMedia | SD278 | For performing AST |
| Trimethoprim antibiotic disc | HiMedia | SD039-5x50DS | For performing AST |
| Tris base | HiMedia | TC072-500G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Vancomycin antibiotic powder | HiMedia | CMS217 | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Weighing Balance | Mettler Toledo | ME204 Mettler Toledo | Used for weighing media powders, reagent powders etc. |
| NA – Not Applicable |
References
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