Isolamento e identificazione di batteri resistenti agli antibiotici trasportati dall'acqua e caratterizzazione molecolare dei loro geni di resistenza agli antibiotici
Summary
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l’isolamento e l’identificazione di batteri resistenti agli antibiotici dall’acqua e la caratterizzazione molecolare dei loro geni di resistenza agli antibiotici (ARG). L’uso di tecniche basate su colture e non basate su colture (analisi metagenomica) fornisce informazioni complete sulla diversità batterica totale e sul pool totale di diversi ARG presenti nelle acque dolci di Mumbai, in India.
Abstract
Lo sviluppo e la diffusione della resistenza agli antibiotici (AR) attraverso il microbiota associato ai corpi d’acqua dolce è una delle principali preoccupazioni per la salute globale. Nel presente studio, sono stati raccolti e analizzati campioni di acqua dolce rispetto alla diversità batterica totale e ai geni AR (ARG) utilizzando sia tecniche convenzionali basate sulla coltura che un approccio metagenomico indipendente dalla coltura ad alto rendimento. Questo articolo presenta un protocollo sistematico per l’enumerazione dei batteri coltivabili totali e resistenti agli antibiotici da campioni di acqua dolce e la determinazione della resistenza fenotipica e genotipica negli isolati coltivabili. Inoltre, riportiamo l’uso dell’intera analisi metagenomica del DNA metagenomico totale estratto dal campione di acqua dolce per l’identificazione della diversità batterica complessiva, compresi i batteri non coltivabili, e l’identificazione del pool totale di diversi ARG (resistoma) nel corpo idrico. Seguendo questi protocolli dettagliati, abbiamo osservato un elevato carico di batteri resistenti agli antibiotici nell’intervallo di 9,6 × 10 5-1,2 × 109 CFU / ml. La maggior parte degli isolati erano resistenti ai molteplici antibiotici testati, tra cui cefotaxime, ampicillina, levofloxacina, cloramfenicolo, ceftriaxone, gentamicina, neomicina, trimetoprim e ciprofloxacina, con indici multipli di resistenza agli antibiotici (MAR) di ≥0,2, indicando alti livelli di resistenza negli isolati. Il sequenziamento dell’rRNA 16S ha identificato potenziali patogeni umani, come Klebsiella pneumoniae, e batteri opportunisti, come Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. e Aeromonas spp. La caratterizzazione molecolare degli isolati ha mostrato la presenza di vari ARG, quali blaTEM, blaCTX-M (β-lattamici), aadA, aac (6′)-Ib (aminoglicosidi) e dfr1 (trimetoprims), confermata anche dall’analisi metagenomica del DNA. Nel DNA metagenomico è stata rilevata anche un’elevata prevalenza di altri ARG che codificano per le pompe di efflusso antibiotico – mtrA, macB, mdtA, acrD, β-lattamasi – SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, il gene cloramfenicolo acetiltransferasi catB10 e il gene di resistenza alla rifampicina rphB – . Con l’aiuto dei protocolli discussi in questo studio, abbiamo confermato la presenza di batteri MAR trasportati dall’acqua con diversi tratti fenotipici e genotipici dell’AR. Pertanto, l’analisi metagenomica del DNA completo può essere utilizzata come tecnica complementare alle tecniche convenzionali basate sulla coltura per determinare lo stato complessivo di AR di un corpo idrico.
Introduction
La resistenza antimicrobica (AMR) è stata identificata come uno dei problemi globali più urgenti. La rapida evoluzione della resistenza antimicrobica e la sua diffusione a livello mondiale rappresentano una delle maggiori minacce per la salute umana e l’economia globale in termini di costi sanitari ad essa associati1. L’uso eccessivo e l’abuso di antibiotici hanno portato ad un aumento dell’AR. Ciò è stato evidenziato dalla pandemia di COVID-19, durante la quale il trattamento delle infezioni secondarie associate, in molti casi, è stato enormemente compromesso a causa della resistenza antimicrobica nei pazienti colpiti2. Oltre all’uso/abuso diretto di antibiotici da parte dell’uomo, l’uso eccessivo e improprio di antibiotici in agricoltura e zootecnia e il loro scarico improprio nell’ambiente, compresi i corpi idrici, costituiscono una delle principali preoccupazioni3. L’aumento di nuovi tratti di resistenza e resistenza multifarmaco nei batteri evidenzia urgentemente la necessità di una migliore comprensione dei fattori che portano allo sviluppo dell’AR e alla sua diffusione. Più batteri resistenti agli antibiotici, che spesso trasportano più geni AR (ARG) su elementi genetici mobili come i plasmidi, possono trasferire questi geni di resistenza a microrganismi non resistenti, compresi potenziali agenti patogeni umani, portando così alla comparsa di superbatteri che non sono trattabili anche con antibiotici di ultima istanza4. Questi molteplici batteri resistenti agli antibiotici, se presenti negli ecosistemi acquatici, possono entrare direttamente nell’intestino umano attraverso il consumo di alimenti contaminati a base d’acqua come pesci, granchi e molluschi. Studi precedenti hanno dimostrato che la diffusione dei batteri AR nei sistemi idrici presenti in natura può raggiungere anche altre riserve idriche, compresa l’acqua potabile, e, quindi, può entrare nella catena alimentare umana 5,6,7.
Lo scopo del presente studio è quello di fornire un protocollo completo utilizzando una combinazione di tecniche basate su colture e non basate su colture (analisi metagenomica completa) per ottenere informazioni complete sulla diversità batterica totale e sul pool totale di diversi ARG presenti in un corpo idrico a Mumbai, in India. Convenzionalmente, sono state utilizzate tecniche basate sulla coltura per studiare la diversità batterica nei corpi idrici. Poiché i microrganismi coltivabili costituiscono solo una piccola percentuale del microbiota totale in qualsiasi nicchia, per avere una migliore comprensione dello stato generale della diversità batterica e dei vari tratti resistenti prevalenti in qualsiasi campione, devono essere utilizzate in tandem varie tecniche basate sulla coltura e indipendenti dalla coltura. Una di queste tecniche robuste e affidabili indipendenti dalla coltura è l’analisi del DNA metagenomico completo. Questo metodo ad alto rendimento è stato utilizzato con successo in vari studi sulla diversità batterica o nelle annotazioni funzionali di vari ARG 8,9. Questa tecnica utilizza il metagenoma (il materiale genetico totale in un campione) come materiale di partenza per varie analisi e, quindi, è indipendente dalla coltura. I protocolli del presente studio possono essere utilizzati per l’analisi dell’intero DNA metagenomico per ottenere informazioni sulla diversità batterica totale e vari ARG (resistoma) in campioni di acqua.
Protocol
Representative Results
Discussion
La raccolta e l’elaborazione dei campioni svolgono un ruolo significativo e potrebbero influenzare i risultati e l’interpretazione dello studio. Pertanto, per escludere la variabilità nei campioni, è importante effettuare campionamenti in più punti del corpo d’acqua dolce studiato. Mantenere condizioni ambientali asettiche adeguate durante la manipolazione di tali campioni può prevenire la contaminazione. Inoltre, per evitare cambiamenti nella composizione batterica che possono influenzare la qualità e la quantità …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto da sovvenzioni finanziarie del Department of Science and Technology-Promotion of University Research and Scientific Excellence (DST-PURSE) Scheme dell’Università di Mumbai. Devika Ghadigaonkar ha lavorato come Project Fellow nell’ambito del programma. Si riconosce l’aiuto tecnico fornito da Harshali Shinde, Senior Research Fellow presso il progetto n. del Department of Science and Technology-Science and Engineering Research Board (DST-SERB): CRG/2018/003624.
Materials
| 100 bp DNA ladder | Himedia | MBT049-50LN | For estimation of size of the amplicons |
| 2x PCR Taq mastermix | HiMedia | MBT061-50R | For making PCR reaction mixture |
| 37 °C Incubator | GS-192, Gayatri Scientific | NA | For incubation of bacteria |
| 6x Gel Loading Buffer | HiMedia | ML015-1ML | Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis |
| Agarose powder | Himedia | MB229-50G | For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Ampicillin antibiotic disc | HiMedia | SD002 | For performing AST |
| Autoclave | Equitron | NA | Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | NA | To check the quality and quantity of the amplified library |
| Bisafety B2 Cabinet | IMSET | IMSET BSC-Class II Type B2 | Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc. |
| Cefotaxime antibiotic disc | HiMedia | SD295E-5VL | For performing AST |
| Cefotaxime antibiotic powder | HiMedia | TC352-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Ceftriaxone antibiotic disc | HiMedia | SD065 | For performing AST |
| Centrifuge Minispin | Eppendorf | Minispin Plus-5453 | Used to pellet the debris during crude DNA preparation |
| Chloramphenicol antibiotic disc | HiMedia | SD006-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD060-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic powder | HiMedia | TC447-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Colorimeter | Quest | NA | For checking the OD of culture suspensions |
| Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database | functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/ | ||
| Cooling Shaker Incubator | BTL41 Allied Scientific | NA | For incubation of media plates for culturing bacteria |
| Deep Freezer (-40 °C) | Haier | DW40L, Haier Biomedicals | For storage of glycerol stocks |
| DNA Library Prep Kit | NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NA | Paired-end sequencing library preparation |
| EDTA | HiMedia | GRM1195-100G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Electrophoresis Apparatus | TechResource | 15 cm gel casting tray | For making the agarose gel and carrying out electrophoresis |
| Electrophoresis Power pack with electrodes | Genei | NA | For running the AGE |
| Erythromycin antibiotic disc | HiMedia | SD222-5VL | For performing AST |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | CMS528-1G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | TC024-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Escherichia coli ATCC 25922 | HiMedia | 0335X-1 | Used as a control while performing AST |
| Ethidium Bromide | HiMedia | MB071-1G | Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System |
| Fluorometer | Qubit 2.0 | NA | For determining concentration of extracted metagenomic DNA |
| Gel Documentation System | BioRad | Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis | |
| Gentamicin antibiotic disc | HiMedia | SD170-5x50DS | For performing AST |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS119-500ML | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Glycerol | HiMedia | GRM1027-500ML | For making glycerol stocks |
| Imipenem antibiotic disc | HiMedia | SD073 | For performing AST |
| Kaiju Database | NA | NA | For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/ |
| Kanamycin antibiotic disc | HiMedia | SD017-5x50DS | For performing AST |
| Kanamycin antibiotic powder | HiMedia | MB105-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Levofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD216-5VL | For performing AST |
| Luria Bertani broth | Himedia | M1245-500G | For enrichment of cultures |
| McFarland Standards | Himedia | R092-1No | To compare density of culture suspension |
| Molecular Biology water | HiMedia | TCL018-500ML | For making PCR reaction mixture |
| Mueller-Hinton Agar (MHA) | HiMedia | M173-500G | For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST) |
| Neomycin antibiotic disc | HiMedia | SD731-5x50DS | For performing AST |
| PCR Gradient Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz | Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes |
| Primers | Xcelris | NA | For PCR amplication |
| R2A Agar, Modified | HiMedia | M1743 | For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load |
| Scaffold generation | CLC Genomics Workbench 6.0 | NA | For generation of scaffolds |
| Sequencer | Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) | NA | Sequencing of amplified library |
| Sodium Chloride | HiMedia | TC046-500G | For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample |
| Soil DNA isolation Kit | Xcelgen | NA | For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 | HiMedia | 0365P | Used as a control while performing AST |
| Taxonomical Classification | Kaiju ioinformatics tool | NA | For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level |
| The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) | NA | NA | For functional annotation of ARGs |
| Tigecycline antibiotic disc | HiMedia | SD278 | For performing AST |
| Trimethoprim antibiotic disc | HiMedia | SD039-5x50DS | For performing AST |
| Tris base | HiMedia | TC072-500G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Vancomycin antibiotic powder | HiMedia | CMS217 | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Weighing Balance | Mettler Toledo | ME204 Mettler Toledo | Used for weighing media powders, reagent powders etc. |
| NA – Not Applicable |
References
- Prestinaci, F., Pezzotti, P., Pantosti, A. Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon. Pathogens and Global Health. 109 (7), 309-318 (2015).
- Knight, G., et al. Antimicrobial resistance and COVID-19: Intersections and implications. Elife. 10, 64139 (2021).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: Part 1: Causes and threats. Pharmacy and Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J. R., Rath, A. Metagenomic analysis of total microbial diversity and antibiotic resistance of culturable microorganisms in raw chicken meat and mung sprouts (Phaseolus aureus) sold in retail markets of Mumbai. India. Current Science. 113 (1), 71-79 (2017).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J., Rath, A. Characterization of multiple antibiotic resistance of culturable microorganisms and metagenomic analysis of total microbial diversity of marine fish sold in retail shops in Mumbai, India. Environmental Science and Pollution Research. 25 (7), 6228-6239 (2018).
- Czekalski, N., GascónDíez, E., Bürgmann, H. Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake. The ISME Journal. 8 (7), 1381-1390 (2014).
- Kraemer, S., Ramachandran, A., Perron, G. Antibiotic pollution in the environment: From microbial ecology to public policy. Microorganisms. 7 (6), 180 (2019).
- Edmonds-Wilson, S., Nurinova, N., Zapka, C., Fierer, N., Wilson, M. Review of human hand microbiome research. Journal of Dermatological Science. 80 (1), 3-12 (2015).
- de Abreu, V., Perdigão, J., Almeida, S. Metagenomic approaches to analyze antimicrobial resistance: An overview. Frontiers in Genetics. 11, 575592 (2021).
- Carlson, S., et al. Detection of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 using multiplex and fluorogenic PCR. Molecular and Cellular Probes. 13 (3), 213-222 (1999).
- Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 12.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Available from: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_12.0_Breakpoint_Tables.pdf (2022)
- Bharti, R., Grimm, D. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Briefings in Bioinformatics. 22 (1), 178-193 (2019).
- Choo, J., Leong, L., Rogers, G. Sample storage conditions significantly influence faecal microbiome profiles. Scientific Reports. 5, 16350 (2015).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. . Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 11th edition. , (2015).
- Bayot, M., Bragg, B. Antimicrobial Susceptibility Testing. StatPearls. , (2021).
- Joseph, A. A., Odimayo, M. S., Olokoba, L. B., Olokoba, A. B., Popoola, G. O. Multiple antibiotic resistance index of Escherichia coli isolates in a tertiary hospital in South-West Nigeria. Medical Journal of Zambia. 44 (4), 225-232 (2017).
- Lorenz, T. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Rolin, J. Food and human gut as reservoirs of transferable antibiotic resistance encoding genes. Frontiers in Microbiology. 4, 173 (2013).
- Racewicz, P., et al. Prevalence and characterisation of antimicrobial resistance genes and class 1 and 2 integrons in multiresistant Escherichia coli isolated from poultry production. Scientific Reports. 12, 6062 (2022).
- Gebreyes, W., Thakur, S. Multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Muenchen from pigs and humans and potential interserovar transfer of antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 503-511 (2005).
- Li, L., et al. Prevalence and characteristics of extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated fluoroquinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from chickens in Anhui Province, China. PLoS One. 9 (8), 104356 (2014).
- Akers, K., et al. Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex. Journal Of Clinical Microbiology. 48 (4), 1132-1138 (2010).
- Ciesielczuk, H. . Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli in the UK: The importance in bacteraemia versus urinary tract infection, colonisation of widespread clones and specific virulence factors. , (2015).
