Bioréacteur de perfusion multi-flux intégré au fractionnement de sortie pour la culture cellulaire dynamique

Résumé

Cet article présente une méthode pour construire et exploiter un système de culture cellulaire de perfusion multicanal à faible coût pour mesurer la dynamique des taux de sécrétion et d’absorption des solutés dans les processus cellulaires. Le système peut également exposer les cellules à des profils de stimulus dynamiques.

Résumé

Certaines fonctions cellulaires et tissulaires fonctionnent dans un délai dynamique de quelques minutes à quelques heures qui sont mal résolues par les systèmes de culture conventionnels. Ce travail a permis de développer un système de bioréacteur de perfusion à faible coût qui permet de perfuser continuellement le milieu de culture dans un module de culture cellulaire et de fractionner dans un module en aval pour mesurer la dynamique à cette échelle. Le système est construit presque entièrement à partir de pièces disponibles dans le commerce et peut être parallélisé pour mener simultanément des expériences indépendantes dans des plaques de culture cellulaire conventionnelles multi-puits. Cet article vidéo montre comment assembler la configuration de base, qui ne nécessite qu’une seule pompe à seringue multicanal et un collecteur de fraction modifié pour perfuser jusqu’à six cultures en parallèle. Des variantes utiles de la conception modulaire sont également présentées qui permettent une dynamique de stimulation contrôlée, telle que des impulsions de soluté ou des profils de type pharmacocinétique. Il est important de noter que lorsque les signaux de soluté traversent le système, ils sont déformés en raison de la dispersion des solutés. En outre, une méthode de mesure des distributions de temps de séjour (RTD) des composants de la configuration de perfusion avec un traceur utilisant MATLAB est décrite. Les RTD sont utiles pour calculer comment les signaux de soluté sont déformés par le flux dans le système à compartiments multiples. Ce système est très robuste et reproductible, de sorte que les chercheurs de base peuvent facilement l’adopter sans avoir besoin d’installations de fabrication spécialisées.

Introduction

De nombreux processus biologiques importants se produisent dans les cultures cellulaires et tissulaires sur une échelle de minutes à^quelques heures ^1,2,3. Bien que certains de ces phénomènes puissent être observés et enregistrés de manière automatisée à l’aide de la microscopie time-lapse⁴, de la bioluminescence¹ ou d’autres méthodes, les expériences impliquant la collecte d’échantillons de surnageants de culture pour analyse chimique sont souvent effectuées manuellement dans des cultures cellulaires statiques. L’échantillonnage....

Protocole

1. Préparer les pièces pour la perfusion de la plaque de puits

1. Préparer les tubes
   1. Couper deux longueurs de tube en silicone (1,6 mm de diamètre intérieur) pour chaque culture cellulaire à perfuser. Assurez-vous que la pièce utilisée comme tube en amont est suffisamment longue pour atteindre la pompe à seringue à la culture cellulaire à l’intérieur de l’incubateur, et que la pièce en aval peut atteindre de la culture cellulaire à la position la plus étendue du collecteur de fractions.
   2. Donnez à chaque morceau de tube une étiquette unique à ses deux extrémités avec du ruban adhésif étiqueté.
2. Préparer le....

Résultats

Le système de perfusion avec plusieurs sources de milieu de la section 5 du protocole a été utilisé pour mesurer la dynamique d’expression d’un gène rapporteur piloté par le facteur nucléaire kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-κB) transcription factor in human embryonic kidney 293 (HEK293) cells en réponse à une impulsion de 1,5 h de facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α). Les cellules HEK293 ont été transduites de manière stable à l’aide de vecteurs lentiviraux avec une construction génique contenant.......

Discussion

Ce travail décrit l’assemblage et le fonctionnement d’un système de culture cellulaire par perfusion avec de multiples sources de milieu démontré avec un exemple spécifique dans lequel la dynamique de l’expression génique induite par NF-κB en réponse à une impulsion transitoire de TNF-α a été mesurée. Les RTD des composants du système de perfusion ont été mesurées et modélisées, et la convolution du signal a été utilisée pour prédire à la fois l’exposition des cellules à l’impulsion α TNF et la distribution α TNF dans le.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Calibre 18 Aiguille de sonde jetable de 1 1/2 po pour une utilisation avec des seringues et des distributeurs	Grainger	5FVK2
293T Cellules	ATCC	CRL-3216	HEK 293T utilisées dans l’expérience des résultats représentatifs.
Plaques de fond transparent à 96 puits, Corning	VWR	89091-010	Plaques pour la mesure des concentrations de colorant dans les expériences de RDT et GLuc dans les expériences de résultats représentatifs.
BD  ; Seringues jetables avec embouts Luer-Lok, 5 mL	Fisher Scientific	14-829-45
BioFrac Fraction Collector  ;	Bio-Rad	7410002	collecteur de fractions qui peut être utilisé pour un seul flux, ou modifié à l’aide de notre méthode pour permettre la collecte à partir de plusieurs flux.
Acrylique transparent à haute résistance résistant aux rayons UV 12 » x 12 » x 1/8	McMaster-Carr	4615T93	Cette feuille est découpée à l’aide d’une découpeuse laser selon le fichier DXF dans les matériaux supplémentaires pour produire le distributeur multi-têtes qui peut être fixé au collecteur de fractions BioFrac.
Coelenterazine native	NanoLight Technology	303	Substrat utilisé dans le test de bioluminescence de la gaussia luciférase dans des résultats représentatifs.
Plaques à puits multiples traitées Corning Costar TC, taille 48 puits, plaque de polystyrène, puits à fond plat	Millipore Sigma	CLS3548	Utilisé pour cultiver et perfuser les cellules 293T dans des résultats représentatifs.
Corning  ; Plaques de culture cellulaire à fond plat Costar, taille 12 puits	Fisher Scientific	720081	Peuvent être bouchées et utilisées comme réservoir agité pour produire des profils pharmacocinétiques en perfusion. Peut également contenir des cellules pour la perfusion.
DMEM, haute teneur en glucose	ThermoFisher Scientific	11965126
Epilog Zing 24 Laser	Cutting Edge Systems	Epilog Zing 24	Découpeuse laser utilisée pour produire un distributeur multi-têtes à partir d’une feuille acrylique. D’autres découpeuses laser peuvent être utilisées.
Fisherbrand Seringues stériles à usage unique, Luer-Lock, 20 mL	Fisher Scientific	14-955-460
Fisherbrand Seringues stériles à usage unique, Luer-Lock, 60 mL	Fisher Scientific	14-955-461
Fisherbrand Premium Microcentrifugeuses Tubes : 1,5 mL	Fisher Scientific	05-408-129	Microcentrifugeuses pour la collecte de fractions.
Fisherbrand  ; Tubes en verre borosilicaté jetables à fond rond avec extrémité lisse	Fisher Scientific	14-961-26	Tubes en verre pour la collecte de fractions.
Fisherbrand  ; Les pointes de pipette SureOne Micropoint, universelles et non filtrées	Scientific	2707410	pointes de pipette de 300 ul qui s’adaptent le mieux au distributeur multi-têtes et à la tubulure pour servir de pointes de distribution.
Gibco  ; DPBS, poudre, sans calcium, sans magnésium	Fisher Scientific	21600010	Saline tamponnée au phosphate.
Agitateur de titre Labline 4625	Marshall Scientific	Agitateur de titre Labline 4625 Agitateur	orbital utilisé pour maintenir les cuves agitées mélangées.
Raccord Masterflex, polycarbonate, robinet d’arrêt à quatre voies, Luer Lock mâle, non stérile ; 10/PK	Cole-Parmer	EW-30600-04	Utilisé pour relier plusieurs flux d’entrée pour les expériences de RTD et les expériences de culture cellulaire.
Raccord Masterflex, Polycarbonate, droit, Luer x capuchon femelle ; 25/PK	Masterflex	UX-45501-28
Raccord Masterflex, polypropylène, droit, adaptateurs Luer à cannelure femelle, 1/16	poCole-Parmer	EW-45508-00
Raccord Masterflex, polypropylène, droit, adaptateur Luer Lock mâle à barbelé, 1/16 po ID	Cole-Parmer	EW-45518-00
Raccord Masterflex, polypropylène, droit, adaptateur Luer Lock mâle vers prise ; 25/PK	Masterflex	EW-30800-30
Tube de pompe de précision Masterflex L/S, silicone durci au platine, L/S 14 ; 25 ft	Masterflex	EW-96410-14
MATLAB	MathWorks	R2019b	Version R2019b. Des versions plus récentes peuvent également être utilisées. Certaines versions plus anciennes peuvent fonctionner.
NE-1600 Pompe à seringue programmable à six canaux	New Era Pump Systems	NE-1600
Rack Set F1	Bio-Rad	7410010	Racks pour maintenir les tubes collecteurs dans le collecteur de fractions.
Protéine recombinante humaine TNF-alpha (exprimée par HEK293), CF	Bio-Techne	10291-TA-020	Cytokine utilisée pour stimuler les cellules 293T dans des résultats représentatifs.
Saint Gobain Solid Stoppers, Silicone Versilic, Taille : 00, Fond 10.5mm	Saint Gobain	DX263015-50	Convient aux plaques de 48 puits.
Saint Gobain Solid Stoppers, Silicone Versilic, Taille : 4 Fond 21mm	Saint Gobain	DX263027-10	Convient aux plaques à 12 puits.
Hydroxyde de sodium, solution aqueuse 10,0 N, APHA ; 1 L	Spectrum Chemicals	S-395-1LT
SolidWorks	Dassault Systems	, logiciel de CAO SolidWorks, utilisé pour créer le fichier DXF du distributeur multi-têtes.
Varioskan LUX lecteur de microplaques multimode	ThermoFisher Scientific	VL0000D0	Lecteur de plaques.
Recharge de base Wilton Color Right Performance Color System, Blue	Michaels	10404779	Colorant alimentaire bleu brillant contenant du bleu brillant FCF, utilisé comme traceur dans les expériences de prêt-à-boire. Le spectre d’absorbance culmine à 628 nm.

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