माउस मॉडल का उपयोग करके पारिवारिक हाइपरट्रॉफिक कार्डियोमायोपैथी में MYH7 उत्परिवर्तन Gly823Glu के रोगजनन की जांच करना
Summary
हमारे नैदानिक कार्य में पाए जाने वाले पारिवारिक वंशानुगत कार्डियोमायोपैथी परिवार के आधार पर, हमने इस उत्परिवर्तन को सत्यापित करने के लिए सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9-मध्यस्थता जीनोम इंजीनियरिंग के माध्यम से माउस MYH7 लोकस पर एक बिंदु उत्परिवर्तन (G823E) के साथ एक C57BL / 6N माउस मॉडल बनाया।
Abstract
पारिवारिक हाइपरट्रॉफिक कार्डियोमायोपैथी (एचसीएम, ओआईएम: 613690) चीन में सबसे आम कार्डियोमायोपैथी है। हालांकि, एचसीएम के अंतर्निहित आनुवंशिक एटियलजि अभी भी अस्पष्ट है।
हमने पहले एचसीएम के साथ एक बड़े चीनी हान परिवार में मायोसिन हेवी चेन 7 (MYH7) जीन विषम संस्करण, NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E) की पहचान की थी। इस परिवार में, वेरिएंट जी 823 ई एक ऑटोसोमल प्रमुख विकार के साथ अलग हो जाता है। यह संस्करण MYH7 प्रोटीन के गर्दन क्षेत्र के लीवर आर्म डोमेन में स्थित है और समरूप मायोसिन और प्रजातियों के बीच अत्यधिक संरक्षित है। जी 823 ई संस्करण की रोगजनकता को सत्यापित करने के लिए, हमने सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9-मध्यस्थता जीनोम इंजीनियरिंग के साथ माउस MYH7 लोकस पर एक बिंदु उत्परिवर्तन (G823E) के साथ एक C57BL / 6N माउस मॉडल का उत्पादन किया। हमने जीआरएनए लक्ष्यीकरण वैक्टर और दाता ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (134 बीपी होमोलॉजी द्वारा लक्षित अनुक्रमों के साथ) डिजाइन किया। दाता ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड में पीजीजी 823 ई (जीजीजी से जीएजी) साइट को होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत द्वारा एमवाईएच 7 के एक्सॉन 23 में पेश किया गया था। होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत के बाद अनुक्रम के जीआरएनए बाइंडिंग और पुन: दरार को रोकने के लिए एक खामोश पी.आर.819 (एजीजी से सीजीए) भी डाला गया था। इकोकार्डियोग्राफी ने 2 महीने की उम्र में एमवाईएच 7 जी 823 ई / – चूहों में सिस्टोल के साथ बाएं वेंट्रिकुलर पश्चवर्ती दीवार (एलवीपीडब्ल्यू) हाइपरट्रॉफी का खुलासा किया। इन परिणामों को हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण (चित्रा 3) द्वारा भी मान्य किया गया था।
इन परिणामों से पता चलता है कि जी 823 ई संस्करण एचसीएम के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हमारे निष्कर्ष पारिवारिक एचसीएम से जुड़े एमवाईएच 7 वेरिएंट के स्पेक्ट्रम को समृद्ध करते हैं और इस चीनी परिवार में आनुवंशिक परामर्श और प्रसवपूर्व निदान के लिए मार्गदर्शन प्रदान कर सकते हैं।
Introduction
हाइपरट्रॉफिक कार्डियोमायोपैथी (एचसीएम, ओआईएम: 613690) चीन में सबसे आम कार्डियोमायोपैथी है, जिसमें 0.2% की अनुमानित घटनाएं हैं, जो 150,000लोगों को प्रभावित करती हैं।
पैथोलॉजिकल शारीरिक विशेषता जो एचसीएम की विशेषता है, असममित वेंट्रिकुलर हाइपरट्रॉफी है, जिसमें अक्सर वेंट्रिकुलर बहिर्वाह पथ और / या इंटरवेंट्रिकुलर सेप्टम3 शामिल होता है। नैदानिक अभिव्यक्ति परिश्रमात्मक डिस्पेनिया, थकान और सीने में दर्द है। एचसीएम के व्यक्तिगत फेनोटाइप में नैदानिक रूप से कपटी से लेकर गंभीर दिल की विफलता तक परिवर्तनशीलता होती है। एचसीएम वाले रोगियों को चिकित्सा उपचार, हृदय प्रत्यारोपण, जीवन समर्थन उपकरण और बहु-विषयक अनुवर्ती की आवश्यकता होतीहै।
पिछली शताब्दी में, पीसीआर तकनीक ने डीएनए5 का अध्ययन करने के तरीके को बदल दिया है। नैदानिक निदान के लिए एक डीएनए अनुक्रमण विधि सेंगर और सहयोगियों द्वाराखोजी गई थी। सेंगर तकनीक को बाद में मानव जीनोम परियोजना पर लागू किया गया था, लेकिन यह दृष्टिकोण महंगा औरसमय लेने वाला था। संपूर्ण जीनोम अनुक्रमण (डब्ल्यूजीएस) के आगमन ने मानव आनुवंशिक बीमारी में अंतर्दृष्टि को नई ऊंचाइयों पर लाया, लेकिन यह लागत के मामले में निषेधात्मक बना रहा। होल-एक्सोम सीक्वेंसिंग (डब्ल्यूईएस) तकनीक का उपयोग लंबे समय से जर्मलाइन वेरिएंट8 का पता लगाने के लिए किया गया है और विभिन्न कैंसर के एक्सोम में दैहिक ड्राइवर म्यूटेशन की पहचान करने में सफल रहाहै। डब्ल्यूईएस द्वारा डीएनए एक्सॉन या कोडिंग क्षेत्रों का पता लगाने का उपयोग अधिकांश मेंडेलियन रोगों में रोगजनक वेरिएंट को प्रकट करने के लिए किया जा सकता है। आज, अनुक्रमण की घटती लागत के साथ, डब्ल्यूजीएस जीनोमिक्स अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण उपकरण बनने की उम्मीद है और जीनोम में रोगजनक वेरिएंट का पता लगाने में व्यापक रूप से उपयोग किया जा सकता है।
डब्ल्यूईएस तकनीक का उपयोग वंशानुगत कार्डियोमायोपैथी में भी किया गया है ताकि एटियलजि को और स्पष्ट करने के लिए रोगजनक वेरिएंट की पहचान की जा सके। उभरते सबूतों ने बताया है कि जीन कोडिंग सरकोमेरे संरचनात्मक प्रोटीन जीन उत्परिवर्तन, जैसे MYH710, MYH611, MYBPC312, MYL213, MYL314, TNNT215, TNNI316, TNNC117, औरTPM1 18 एचसीएम के आनुवंशिक एटियलजि के लिए जिम्मेदार हैं। दुर्लभ रोग पैदा करने वाले जीनों (जैसे, ऑब्स्स्क्यूलिन, साइटोस्केलेटल कैलमोडुलिन और टिटिन-इंटरैक्टिंग रोडएफ (ओबीएससीएन, ओआईएम: 608616)19, एक्टिंग अल्फा 2 (एसीटीएन 2, ओआईएम: 102573)20, और सिस्टीन और ग्लाइसिन समृद्ध प्रोटीन 3 (सीएसआरपी 3, ओआईएम: 600824)21) में रोगजनक वेरिएंट के बारे में जागरूकता भी एचसीएम से जुड़ी हुई है। वर्तमान आनुवंशिक अध्ययनों ने लगभग 40% -60% एचसीएम रोगियों में सरकोमेरिक प्रोटीन जीन में कई अलग-अलग रोगजनक रूपों की पहचान की है, और एचसीएम रोगियों में आनुवंशिक परीक्षण से पता चला है कि अधिकांश रोगजनक वेरिएंट मायोसिन भारी श्रृंखला (MYH7) और मायोसिन-बाइंडिंग प्रोटीन C (MYBPC3) में होते हैं। हालांकि, एचसीएम के लिए आनुवंशिक आधार अभी भी अज्ञात है। मानव एचसीएम रोगियों को रेखांकित करने वाले इन विविधताओं की रोगजनकता की खोज करना एकबड़ी चुनौती बनी हुई है।
इस अध्ययन में, हम डब्ल्यूईएस द्वारा एचसीएम के साथ एक चीनी हान परिवार में एमवाईएच 7 में एक रोगजनक संस्करण की रिपोर्ट करते हैं। इस वेरिएंट की रोगजनकता को सत्यापित करने के लिए, हमने सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 प्रणाली का उपयोग करके चूहों में एक सी 57 बीएल / 6 एन-मायह 7ईएम 1 (जी 823 ई) नॉकिन स्थापित किया। हम इस संस्करण के प्रशंसनीय तंत्र पर भी चर्चा करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में, हम एचसीएम के साथ एक चीनी हान परिवारों का वर्णन करते हैं। जेनेटिक्स विश्लेषण से पता चला है कि एक विषम एमवाईएच 6 उत्परिवर्तन पी.जी.823 ई ऑटोसोमल प्रमुख वंशानुक्रम वाले परिवार के सदस्यों में ब?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को गुआंग्डोंग प्रांत (ए 2022363) की चिकित्सा अनुसंधान निधि परियोजना और गुआंग्डोंग कमेटी ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी, चीन (अनुदान संख्या 2022) की प्रमुख परियोजना द्वारा समर्थित किया गया था।
हम इस पांडुलिपि की तैयारी के दौरान मदद के लिए मैरीलैंड विश्वविद्यालय, कॉलेज पार्क के किंगजियान चेन को धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| 0.5×TBE | Shanghai Sangon | ||
| 2× Taq Master Mix (Dye Plus) | Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Agarose | Regu | ||
| Anesthesia machine for small animals | Reward Life Technology Co., Ltd. | R500 | |
| BEDTools | 2.16.1 | ||
| Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit | Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. | VK007 | |
| DNA Marker | Thermo Fisher Scientific | ||
| DNA stabilizer | Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. | DNAstable LD | prevent DNA degradation |
| Electric paraffin microtome | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-S7220-B | |
| GATK | v3.5 | ||
| Gentra Puregene blood kit | Santa Clara | ||
| Glass slide, coverslip | Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution | Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. | C0107-500ml, C0109 | |
| HiSeq X-ten platform | Illumina | perform sequencing on the captured libraries | |
| Injection of chorionic gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Injection of pregnant mare serum gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Isoflurane | Local suppliers | inhalation anesthesia | |
| Microinjection microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000 | |
| Paraffin Embedding Machine | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-B7126-B | |
| Picard | (2.2.4) 20 | ||
| Proteinase K | Merck KGaA | ||
| samtools | 1.3 | ||
| Sequencer | Applied Biosystems | ABI 3500 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | |
| SureSelect Human All Exon V6 | Agilent Technology Co., Ltd. | exome probe | |
| T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs, Inc. | NEB-E2065S | |
| Temperature box | BINDER GmbH | KBF-S Solid.Line | |
| Trizma Hydrochloride Solution | Sigma, Merck KGaA | No. T2663 | |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips | CX50 |
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