마우스 모델을 사용한 가족성 비후성 심근병증에서 MYH7 돌연변이 Gly823Glu의 발병기전 조사
Summary
임상 연구에서 발견된 가족성 유전성 심근병증 계열을 기반으로 이 돌연변이를 확인하기 위해 CRISPR/Cas9 매개 게놈 엔지니어링을 통해 마우스 MYH7 유전자좌에서 점 돌연변이(G823E)가 있는 C57BL/6N 마우스 모델을 만들었습니다.
Abstract
가족성 비대성 심근병증(HCM, OMIM: 613690)은 중국에서 가장 흔한 심근병증입니다. 그러나 HCM의 근본적인 유전 적 원인은 여전히 파악하기 어렵습니다.
우리는 이전에 HCM을 가진 큰 중국 한족에서 미오신 중쇄 7 (MYH7) 유전자 이형 접합 변이체 NM_000257.4 : c.G2468A (p.G823E)를 확인했습니다. 이 계열에서 변종 G823E는 상 염색체 우성 장애와 분리됩니다. 이 변이체는 MYH7 단백질의 목 영역의 레버 암 도메인에 위치하며 상동 미오신 및 종 사이에서 고도로 보존됩니다. G823E 변이체의 병원성을 확인하기 위해 CRISPR/Cas9 매개 게놈 공학을 통해 마우스 MYH7 유전자좌에서 점 돌연변이(G823E)가 있는 C57BL/6N 마우스 모델을 제작했습니다. gRNA 표적화 벡터와 공여자 올리고뉴클레오티드(표적화 서열이 134bp의 상동성 옆에 있음)를 설계했습니다. 공여체 올리고뉴클레오티드 내의 p.G823E (GGG 내지 GAG) 부위를 상동성-지시 복구에 의해 MYH7의 엑손 23 내로 도입하였다. 침묵된 p.R819 (AGG 대 CGA)를 또한 삽입하여 gRNA 결합 및 상동성 지향적 복구 후 서열의 재절단을 방지하였다. 심 초음파는 생후 2 개월에 MYH7 G823E /- 마우스에서 수축기가있는 좌심실 후벽 (LVPW) 비대를 나타 냈습니다. 이러한 결과는 마찬가지로 조직학적 분석에 의해 검증되었습니다(그림 3).
이러한 결과는 G823E 변이체가 HCM의 발병기전에 중요한 역할을 한다는 것을 입증한다. 우리의 연구 결과는 가족 성 HCM과 관련된 MYH7 변종의 스펙트럼을 풍부하게하고이 중국 가족의 유전 상담 및 산전 진단에 대한 지침을 제공 할 수 있습니다.
Introduction
비대성 심근 병증 (HCM, OMIM : 613690)은 중국에서 가장 흔한 심근 병증으로 추정 발병률은 0.2 %로 150,000 명에게 영향을 미칩니다 1,2.
HCM을 특징 짓는 병리학 적 해부학 적 특징은 비대칭 심실 비대이며, 이는 종종 심실 유출로 및 / 또는 심실 중격3을 포함합니다. 임상 증상은 운동 호흡 곤란, 피로 및 흉통입니다. HCM의 개별 표현형은 임상 적으로 교활한 심부전에서 심각한 심부전에 이르기까지 다양합니다. HCM 환자는 치료, 심장 이식, 생명 유지 장비 및 다 분야 추적 관찰이 필요합니다4.
지난 세기 동안 PCR 기술은 우리가 DNA5를 연구하는 방식을 변화 시켰습니다. 임상 진단을위한 DNA 시퀀싱 방법은 Sanger와 동료6에 의해 발견되었습니다. Sanger 기술은 이후 인간 게놈 프로젝트에 적용되었지만 이 접근 방식은 비용과시간이 많이 소요되었습니다7. 전체 게놈 시퀀싱(WGS)의 출현으로 인간 유전 질환에 대한 통찰력이 새로운 차원으로 올라갔지만 비용 측면에서는 여전히 엄두가 나지 않았습니다. 전체 엑솜 시퀀싱(WES) 기술은 생식계열 변이체8를 검출하기 위해 오랫동안 사용되어 왔으며 다양한 암9의 엑솜에서 체세포 동인 돌연변이를 확인하는 데 성공적이었습니다. WES에 의한 DNA 엑손 또는 코딩 영역의 검출은 대부분의 멘델 질환에서 병원성 변이를 밝히는 데 사용될 수 있습니다. 오늘날 시퀀싱 비용이 감소함에 따라 WGS는 유전체학 연구에서 중요한 도구가 될 것으로 예상되며 게놈의 병원성 변이 검출에 널리 사용될 수 있습니다.
WES 기술은 또한 유전성 심근 병증에서 병인을 더 밝히기 위해 병원성 변이를 식별하는 데 사용되었습니다. 새로운 증거는 MYH7 10, MYH6 11, MYBPC3 12, MYL2 13, MYL3 14, TNNT2 15, TNNI3 16, TNNC1 17 및 TPM1 18과 같은 육종 구조 단백질 유전자 돌연변이를 코딩하는 유전자가 HCM의 유전 적 병인을 담당한다는 것을 암시합니다. 희귀 질환 유발 유전자(예: 옵스큐린, 세포골격 칼모듈린 및 티틴 상호작용 RhoGEF (OBSCN, OMIM: 608616)19, 작용 알파 2 (ACTN2, OMIM: 102573)20, 시스테인 및 글리신이 풍부한 단백질 3(CSRP3, OMIM: 600824)21)의 병원성 변이에 대한 인식도 HCM과 관련이 있습니다. 현재의 유전 연구는 HCM 환자의 약 40 % -60 %에서 육종 단백질 유전자에서 여러 가지 별개의 병원성 변이를 확인했으며, HCM 환자의 유전자 검사에서 대부분의 병원성 변이체가 미오신 중쇄 (MYH7) 및 미오신 결합 단백질 C (MYBPC3). 그러나 HCM의 유전 적 기초는 여전히 파악하기 어렵습니다. 인간 HCM 환자의 기초가되는 이러한 변이의 병원성을 탐구하는 것은 주요 과제로 남아 있습니다22.
이 연구에서는 WES의 HCM을 가진 중국 한족의 MYH7의 병원성 변이를 보고합니다. 이 변종의 병원성을 확인하기 위해 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 C57BL/6N-Myh7em1(G823E) 노킨 마우스를 구축했습니다. 우리는 또한이 변종의 그럴듯한 메커니즘에 대해서도 논의합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구에서는 HCM을 가진 한 중국 한족 가족을 설명합니다. 유전학 분석에 따르면 이형 접합체 MYH6 돌연변이 p.G823E는 상 염색체 우성 유전을 가진 가족 구성원에서이 질병과 공동 분리됩니다. G823E 돌연변이의 병원성을 검증하고 기본 메커니즘을 논의하기 위해 CRISPR/Cas9 매개 게놈 엔지니어링에 의해 마우스 Myh7 유전자좌에서 G823E를 사용하여 C57BL/6N 마우스 모델을 만들었습니다.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 광동성 의료 연구 기금 프로젝트(A2022363)와 중국 광둥 과학 기술 위원회의 주요 프로젝트(보조금 번호 2022)의 지원을 받았습니다.
이 원고를 준비하는 동안 도움을 주신 메릴랜드 대학교 칼리지 파크의 Qingjian Chen에게 감사드립니다.
Materials
| 0.5×TBE | Shanghai Sangon | ||
| 2× Taq Master Mix (Dye Plus) | Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Agarose | Regu | ||
| Anesthesia machine for small animals | Reward Life Technology Co., Ltd. | R500 | |
| BEDTools | 2.16.1 | ||
| Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit | Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. | VK007 | |
| DNA Marker | Thermo Fisher Scientific | ||
| DNA stabilizer | Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. | DNAstable LD | prevent DNA degradation |
| Electric paraffin microtome | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-S7220-B | |
| GATK | v3.5 | ||
| Gentra Puregene blood kit | Santa Clara | ||
| Glass slide, coverslip | Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution | Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. | C0107-500ml, C0109 | |
| HiSeq X-ten platform | Illumina | perform sequencing on the captured libraries | |
| Injection of chorionic gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Injection of pregnant mare serum gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Isoflurane | Local suppliers | inhalation anesthesia | |
| Microinjection microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000 | |
| Paraffin Embedding Machine | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-B7126-B | |
| Picard | (2.2.4) 20 | ||
| Proteinase K | Merck KGaA | ||
| samtools | 1.3 | ||
| Sequencer | Applied Biosystems | ABI 3500 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | |
| SureSelect Human All Exon V6 | Agilent Technology Co., Ltd. | exome probe | |
| T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs, Inc. | NEB-E2065S | |
| Temperature box | BINDER GmbH | KBF-S Solid.Line | |
| Trizma Hydrochloride Solution | Sigma, Merck KGaA | No. T2663 | |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips | CX50 |
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