Undersøkelse av patogenesen av MYH7-mutasjonen Gly823Glu i familiær hypertrofisk kardiomyopati ved hjelp av en musemodell
Summary
Basert på den familiære arvelige kardiomyopatifamilien som ble funnet i vårt kliniske arbeid, opprettet vi en C57BL / 6N musemodell med en punktmutasjon (G823E) ved musen MYH7-lokus gjennom CRISPR / Cas9-mediert genomteknikk for å verifisere denne mutasjonen.
Abstract
Familiær hypertrofisk kardiomyopati (HCM, OMIM: 613690) er den vanligste kardiomyopatien i Kina. Imidlertid forblir den underliggende genetiske etiologien til HCM unnvikende.
Vi har tidligere identifisert en myosin tung kjede 7 (MYH7) gen heterozygot variant, NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E), i en stor kinesisk Han-familie med HCM. I denne familien kosegregerer variant G823E med en autosomal dominant lidelse. Denne varianten ligger i spakarmdomenet til nakkeområdet til MYH7-proteinet og er svært konservert blant homologe myosiner og arter. For å verifisere patogeniteten til G823E-varianten produserte vi en C57BL/6N-musemodell med punktmutasjon (G823E) ved musens MYH7-lokus med CRISPR/Cas9-mediert genomteknikk. Vi designet gRNA-målrettingsvektorer og donoroligonukleotider (med målrettingssekvenser flankert av 134 bp homologi). P.G823E (GGG til GAG) -stedet i donoroligonukleotid ble introdusert i ekson 23 av MYH7 ved homologi-rettet reparasjon. En lydløs p.R819 (AGG til CGA) ble også satt inn for å forhindre gRNA-binding og re-spalting av sekvensen etter homologi-rettet reparasjon. Ekkokardiografi viste venstre ventrikkels bakre vegg (LVPW) hypertrofi med systole i MYH7 G823E/- mus ved 2 måneders alder. Disse resultatene ble også validert ved histologisk analyse (figur 3).
Disse resultatene viser at G823E-varianten spiller en viktig rolle i patogenesen av HCM. Våre funn beriker spekteret av MYH7-varianter knyttet til familiær HCM og kan gi veiledning for genetisk rådgivning og fosterdiagnostikk i denne kinesiske familien.
Introduction
Hypertrofisk kardiomyopati (HCM, OMIM: 613690) er den vanligste kardiomyopatien i Kina, med en estimert forekomst på 0,2%, som påvirker 150 000 personer 1,2.
Det patologiske anatomiske trekket som karakteriserer HCM er asymmetrisk ventrikkelhypertrofi, som ofte involverer ventrikkels utstrømningskanal og/eller interventrikulær septum3. Den kliniske manifestasjonen er anstrengende dyspné, tretthet og brystsmerter. Den individuelle fenotypen av HCM har variabilitet som spenner fra klinisk lumsk til alvorlig hjertesvikt. Pasienter med HCM krever medisinsk behandling, hjertetransplantasjon, livsstøtteutstyr og tverrfaglig oppfølging4.
I det siste århundret har PCR-teknologi endret måten vi studerer DNA5 på. En DNA-sekvenseringsmetode for klinisk diagnose ble oppdaget av Sanger og kolleger6. Sanger-teknikken ble senere brukt på Human Genome Project, men denne tilnærmingen var kostbar og tidkrevende7. Ankomsten av helgenomsekvensering (WGS) brakte innsikt i menneskelig genetisk sykdom til nye høyder, men det forble uoverkommelig når det gjelder kostnad. Hel-eksomsekvenseringsteknologi (WES) har lenge vært brukt til å oppdage kimlinjevarianter8 og har vært vellykket i å identifisere somatiske drivermutasjoner i eksomet av ulike kreftformer9. Påvisning av DNA-eksoner eller kodende regioner ved WES kan brukes til å avsløre patogene varianter i de fleste mendelske sykdommer. I dag, med de reduserte kostnadene ved sekvensering, forventes WGS å bli et viktig verktøy i genomforskning og kan brukes mye i påvisning av patogene varianter i genomet.
WES-teknologi har også blitt brukt i arvelig kardiomyopati for å identifisere patogene varianter for ytterligere å belyse etiologien. Nye bevis har implisert at gener som koder for sarkomere strukturelle proteingenmutasjoner, som MYH7 10, MYH6 11, MYBPC3 12, MYL2 13, MYL3 14, TNNT215, TNNI3 16, TNNC117 ogTPM1 18 er ansvarlige for HCMs genetiske etiologi. Bevissthet om patogene varianter i sjeldne sykdomsfremkallende gener (f.eks. obscurin, cytoskeletal calmodulin og titin-interagerende RhoGEF (OBSCN, OMIM: 608616)19, virkende alfa 2 (ACTN2, OMIM: 102573)20, og cystein- og glycinrikt protein 3 (CSRP3, OMIM: 600824)21) har også vært assosiert med HCM. Nåværende genetiske studier har identifisert flere forskjellige patogene varianter i det sarkomeriske proteingenet hos ca. 40% -60% av HCM-pasientene, og genetisk testing hos HCM-pasienter viste at de fleste patogene varianter forekommer i myosin tung kjede (MYH7) og myosinbindende protein C (MYBPC3). Imidlertid er det genetiske grunnlaget for HCM fortsatt unnvikende. Å utforske patogeniteten til disse variasjonene som ligger til grunn for de menneskelige HCM-pasientene, er fortsatt en stor utfordring22.
I denne studien rapporterer vi en patogen variant i MYH7 i en kinesisk Han-familie med HCM av WES. For å verifisere patogeniteten til denne varianten, etablerte vi en C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E) knockinmus ved hjelp av CRISPR / Cas9-systemet. Vi diskuterer også plausible mekanismer for denne varianten.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne studien beskriver vi en kinesisk Han-familie med HCM. Genetikkanalyse viste at en heterozygot MYH6-mutasjon p.G823E samsegregerer med sykdommen hos familiemedlemmer med autosomal dominant arv. For å validere patogeniteten til G823E-mutasjonen og diskutere de underliggende mekanismene, opprettet vi en C57BL / 6N musemodell med G823E ved mus Myh7-lokus ved CRISPR / Cas9-mediert genomteknikk.
Fenotypiske egenskaper av C57BL/6N-Myh7em1(G823E) knockinmus ble evaluert ved ekkokar…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av det medisinske forskningsfondsprosjektet i Guangdong-provinsen (A2022363) og det store prosjektet til Guangdong Committee of Science and Technology, Kina (grant no.2022).
Vi vil gjerne takke Qingjian Chen fra University of Maryland, College Park for hjelpen under utarbeidelsen av dette manuskriptet.
Materials
| 0.5×TBE | Shanghai Sangon | ||
| 2× Taq Master Mix (Dye Plus) | Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Agarose | Regu | ||
| Anesthesia machine for small animals | Reward Life Technology Co., Ltd. | R500 | |
| BEDTools | 2.16.1 | ||
| Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit | Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. | VK007 | |
| DNA Marker | Thermo Fisher Scientific | ||
| DNA stabilizer | Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. | DNAstable LD | prevent DNA degradation |
| Electric paraffin microtome | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-S7220-B | |
| GATK | v3.5 | ||
| Gentra Puregene blood kit | Santa Clara | ||
| Glass slide, coverslip | Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution | Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. | C0107-500ml, C0109 | |
| HiSeq X-ten platform | Illumina | perform sequencing on the captured libraries | |
| Injection of chorionic gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Injection of pregnant mare serum gonadotropin | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Isoflurane | Local suppliers | inhalation anesthesia | |
| Microinjection microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000 | |
| Paraffin Embedding Machine | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-B7126-B | |
| Picard | (2.2.4) 20 | ||
| Proteinase K | Merck KGaA | ||
| samtools | 1.3 | ||
| Sequencer | Applied Biosystems | ABI 3500 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ745T | |
| SureSelect Human All Exon V6 | Agilent Technology Co., Ltd. | exome probe | |
| T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs, Inc. | NEB-E2065S | |
| Temperature box | BINDER GmbH | KBF-S Solid.Line | |
| Trizma Hydrochloride Solution | Sigma, Merck KGaA | No. T2663 | |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips | CX50 |
References
- Toepfer, C. N., et al. Myosin sequestration regulates sarcomere function, cardiomyocyte energetics, and metabolism, informing the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 141 (10), 828-842 (2020).
- Writing Committee Members et al. 2020 AHA/ACC guideline for the diagnosis and treatment of patients with hypertrophic cardiomyopathy: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Joint Committee on Clinical Practice Guidelines. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 162 (1), 23-106 (2021).
- Elliott, P., McKenna, W. J. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 363 (9424), 1881-1891 (2004).
- Maron, B. J., Maron, M. S. Hypertrophic cardiomyopathy. Lancet. 381 (9862), 242-255 (2013).
- Inoue, T., Orgel, L. E. A nonenzymatic RNA polymerase model. Science. 219 (4586), 859-862 (1983).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Sachidanandam, R., et al. A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. Nature. 409 (6822), 928-933 (2001).
- Ng, S. B., et al. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature. 461 (7261), 272-276 (2009).
- Wong, K. M., Hudson, T. J., McPherson, J. D. Unraveling the genetics of cancer: genome sequencing and beyond. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 12, 407-430 (2011).
- Mattivi, C. L., et al. Clinical utility of a phenotype-enhanced MYH7-specific variant classification framework in hypertrophic cardiomyopathy genetic testing. Circulation. Genomic and Precision Medicine. 13 (5), 453-459 (2020).
- Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science. 342 (6154), 111-114 (2013).
- Hayashi, T., et al. Genetic background of Japanese patients with pediatric hypertrophic and restrictive cardiomyopathy. Journal of Human Genetics. 63 (9), 989-996 (2018).
- Gil, W. S., Ávila Vidal, L. A., Vásquez Salguero, M. A., Cajiao, M. B., Peña, C. V. Genetic variant affecting the myosin light chain 2 related to familial hypertrophic cardiomyopathy. Intractable & Rare Diseases Research. 9 (4), 229-232 (2020).
- Berge, K. E., Leren, T. P. Genetics of hypertrophic cardiomyopathy in Norway. Clinical Genetics. 86 (4), 355-360 (2014).
- McNamara, J. W., Schuckman, M., Becker, R. C., Sadayappan, S. A novel homozygous intronic variant in TNNT2 associates with feline cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 608473 (2020).
- Wang, W., et al. Comparative transcriptome analysis of atrial septal defect identifies dysregulated genes during heart septum morphogenesis. Gene. 575, 303-312 (2016).
- Andersen, P. S., et al. Diagnostic yield, interpretation, and clinical utility of mutation screening of sarcomere encoding genes in Danish hypertrophic cardiomyopathy patients and relatives. Human Mutations. 30 (3), 363-370 (2009).
- Nakashima, Y., et al. Lifelong clinical impact of the presence of sarcomere gene mutation in Japanese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Circulation Journal. 84 (10), 1846-1853 (2020).
- Hu, L. R., Kontrogianni-Konstantopoulos, A. Proteomic analysis of myocardia containing the Obscurin R4344Q mutation linked to hypertrophic cardiomyopathy. Frontiers in Physiology. 11, 478 (2020).
- Girolami, F., et al. Novel alpha-actinin 2 variant associated with familial hypertrophic cardiomyopathy and juvenile atrial arrhythmias: a massively parallel sequencing study. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (6), 741-750 (2014).
- Salazar-Mendiguchia, J., et al. The p.(Cys150Tyr) variant in CSRP3 is associated with late-onset hypertrophic cardiomyopathy in heterozygous individuals. European Journal of Medical Genetics. 63 (12), 104079 (2020).
- Teekakirikul, P., Zhu, W., Huang, H. C., Fung, E. Hypertrophic cardiomyopathy: An overview of genetics and management. Biomolecules. 9 (12), 878 (2019).
- Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
- Song, L., et al. Mutations profile in Chinese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 209-216 (2005).
- Marian, A. J., Braunwald, E. Hypertrophic cardiomyopathy: Genetics, pathogenesis, clinical manifestations, diagnosis, and therapy. Circulation Research. 121 (7), 749-770 (2017).
- Cann, F., et al. Phenotype-driven molecular autopsy for sudden cardiac death. Clinical Genetics. 91 (1), 22-29 (2017).
- Lafreniere-Roula, M., et al. Family screening for hypertrophic cardiomyopathy: Is it time to change practice guidelines. European Heart Journal. 40 (45), 3672-3681 (2019).
- Winkelmann, D. A., Forgacs, E., Miller, M. T., Stock, A. M. Structural basis for drug-induced allosteric changes to human beta-cardiac myosin motor activity. Nature Communications. 6, 7974 (2015).
- García-Giustiniani, D., et al. Phenotype and prognostic correlations of the converter region mutations affecting the β myosin heavy chain. Heart (British Cardiac Society). 101 (13), 1047-1053 (2015).
- Moore, J. R., Leinwand, L., Warshaw, D. M. Understanding cardiomyopathy phenotypes based on the functional impact of mutations in the myosin motor. Circulation Research. 111 (3), 375-385 (2012).
- Majewski, J., Schwartzentruber, J., Lalonde, E., Montpetit, A., Jabado, N. What can exome sequencing do for you. Journal of Medical Genetics. 48 (9), 580-589 (2011).
