Visualisering af de morfologiske egenskaber ved neuromuskulært kryds i rotte medial gastrocnemius muskel

Summary

Protokollen viser en metode til at undersøge rumlig korrelation mellem de præsynaptiske terminaler, postsynaptiske receptorer og perisynaptiske Schwann-celler i rottemediale gastrocnemiusmuskel ved hjælp af fluorescerende immunohistokemi med forskellige biomarkører, nemlig neurofilament 200, vesikulær acetylcholintransportør, alfa-bungarotoxin og S100.

Abstract

Det neuromuskulære kryds (NMJ) er en kompleks struktur, der tjener til signalkommunikation fra motorneuronen til skeletmuskulaturen og består af tre væsentlige histologiske komponenter: de præsynaptiske motor axonterminaler, postsynaptiske nikotinacetylcholinreceptorer (AchR’er) og perisynaptiske Schwann-celler (PSC’er). For at demonstrere NMJ’s morfologiske egenskaber blev rottemediale gastrocnemiusmuskel udvalgt som målvæv og undersøgt ved anvendelse af flere fluorescerende farvninger med forskellige slags biomarkører, herunder neurofilament 200 (NF200) og vesikulær acetylcholintransportør (VAChT) til motornervefibrene og deres præsynaptiske terminaler, alfa-bungarotoxin (α-BTX) til de postsynaptiske nikotiniske AchR’er, og S100 til kvikskrankerne. I denne undersøgelse blev farvning udført i to grupper: i den første gruppe blev prøver farvet med NF200, VAChT og α-BTX, og i den anden gruppe blev prøver farvet med NF200, α-BTX og S100. Det blev vist, at begge protokoller effektivt kan demonstrere NMJ’s detaljerede struktur. Ved hjælp af det konfokale mikroskop blev morfologiske egenskaber ved de præsynaptiske terminaler, postsynaptiske receptorer og PSC set, og deres Z-stakkebilleder blev rekonstrueret i et tredimensionelt mønster for yderligere at analysere den rumlige sammenhæng mellem de forskellige mærkninger. Fra metodologisk perspektiv giver disse protokoller en værdifuld reference til undersøgelse af NMJ’s morfologiske egenskaber under fysiologiske forhold, hvilket også kan være egnet til at evaluere den patologiske ændring af NMJ, såsom perifer nerveskade og regenerering.

Introduction

Da tre væsentlige strukturelle komponenter i det neuromuskulære kryds (NMJ)1,2,3,4 er morfologiske aspekter af de præsynaptiske motoraksonterminaler, postsynaptisk membran indeholdende nikotinacetylcholinreceptorer (AchR’er) og perisynaptiske Schwann-celler (PSC’er) blevet grundigt undersøgt. Tynde sektioner og helmonterede prøver af skeletmusklerne er blevet undersøgt med forskellige histologiske teknikker, såsom elektronmikroskopi ^5,6, konfokal mikroskopi ^7,8 og lysarkmikroskopi ^9,10. Selvom NMJ’s morfologiske egenskaber er blevet demonstreret af disse teknikker fra forskellige aspekter, er konfokal mikroskopi som sammenligning stadig et ideelt valg til billeddannelse af NMJ’s detaljerede morfologi.

For nylig er der udviklet mange nye teknologier til at vise de strukturelle komponenter i NMJ. For eksempel er thy1-YFP transgene fluorescerende mus blevet direkte brugt til at observere motoraksoner og motoriske endeplader in vivo og in vitro^10,11. Derudover er intravenøs injektion af fluorescerende α-BTX blevet anvendt til at afsløre den rumlige fordeling af motoriske endeplader i helmonterede skeletmuskler af vildtype og transgene fluorescerende mus ved hjælp af vævsoptisk clearingbehandling til undersøgelse med lysarkmikroskopi ^9,12. Ud over de præ- og postsynaptiske elementer, der kan ses ved hjælp af disse avancerede metoder, kan kvikskrankerne imidlertid ikke påvises på samme tid.

Akkumulerende beviser indikerer, at PSC’er, som de perifere gliaceller, er tæt forbundet med de præsynaptiske terminaler, der bidrager til udviklingen og stabiliteten af NMJ, modulering af NMJ’s synaptiske aktivitet under den fysiologiske tilstand og regenerering af NMJ efter nerveskade 13,14,15 . I betragtning af NMJ’s cellulære arkitektur er denne protokol en passende kandidat til samtidig at mærke PSC’erne, præ- og postsynaptiske elementer og bruges potentielt til at evaluere NMJ’s integritet og plasticitet under normale og patologiske forhold_. Sammenlign for eksempel intensiteten af NMJ, morfologi og volumen af postsynaptiske motoriske endeplader, innervering og denervation af NMJ og antal PSC’er i muskler med fysiologisk og patologisk status.

Gastrocnemiusmusklen er den største muskel, der danner bulen i læggen, som let dissekeres ved at fjerne huden og biceps femoris-musklen fra lemmen. Musklen vælges ofte til at vurdere muskelatrofi, neuromuskulær degeneration, muskelydelse og motorisk enhedskraft ex vivo eller in vivo 16,17,18. Teknikken er imidlertid også velegnet til at afsløre NMJ’s morfologiske egenskaber fra forskellige skeletmuskler. Samtidig kan de tykke muskelsektioner afsløre mere komplet morfologi og mængde NMJ sammenlignet med tynde sektioner ^7,8 og drillede muskelfibre¹⁹.

I overensstemmelse med disse undersøgelser blev rottemediale gastrocnemiusmuskel valgt som målvæv i denne undersøgelse og blev skåret i en tykkelse på 80 μm til multipel fluorescerende farvning med forskellige slags biomarkører i henhold til de strukturelle komponenter i NMJ. Her blev neurofilament 200 (NF200)^20,21, vesikulær acetylcholintransportør (VAChT)²², alfa-bungarotoxin (α-BTX)^23,24 og S100^25,26 brugt til at mærke henholdsvis nervefibre, præsynaptiske terminaler, postsynaptiske AchR’er og PSC’er. Derudover blev baggrunden for muskelvæv og cellulære kerner yderligere modvirket med phalloidin og DAPI.

I denne undersøgelse forventer vi at udvikle en raffineret protokol til samtidig farvning af NMJ’s cellulære arkitektur med deres tilsvarende biomarkører på tykkere faste prøver, hvilket er mere praktisk til brug i konfokal mikroskopi og hjælper med at opnå meget mere information om den detaljerede struktur af PSC’erne, præ- og postsynaptiske elementer samt deres rumlige sammenhæng med hinanden. Fra metodologisk perspektiv kan denne protokol med fordel evaluere NMJ’s morfologiske egenskaber under normale og patologiske forhold.

Protocol

Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité for Institut for Akupunktur og Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (godkendelse nr. 2021-04-15-1). Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide for pleje og brug af forsøgsdyr (National Academy Press, Washington, DC, 1996). Tre voksne hanrotter (Sprague-Dawley, vægt 230 ± 15 g) blev brugt. Rotterne blev opstaldet i en 12 timers lys/mørk cyklus med kontrolleret temperatur og fugtighed og med fri adgang…

Representative Results

Efter flere fluorescerende farvninger blev den tilsvarende mærkning ordnet demonstreret på de 80 μm tykke sektioner af rottemediale gastrocnemiusmuskel med NF200-positive nervefibre, VAChT-positive præsynaptiske terminaler, α-BTX-positive postsynaptiske AchR’er, S100-positive PSC’er, phalloidin-positive muskelfibre og DAPI-mærkede cellulære kerner (figur 3 og figur 4). Det blev vist, at NF200-positive nervefibre løb i bundt og…

Discussion

Vi har beskrevet de tekniske detaljer, der kræves for at udføre vellykket multipel farvning af muskelskiver og anvendelse af fluorescerende immunohistokemi til at afsløre NMJ’s morfologiske egenskaber på de tykke sektioner af rottemediale gastrocnemiusmusklen. Ved at bruge denne tilgang kan de fine detaljer og rumlige korrelation mellem PSC’erne og præ- og postsynaptiske elementer analyseres og værdsættes under konfokal mikroskopi og yderligere rekonstrueres i et tredimensionelt mønster. Her blev forskellige slag…

Materials

4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	ThermoFisher	D3571
Confocal laser scanning microscope	Olympus	FV1200
Donkey anti-chicken AF488	Jackson	149973 (703-545-155)
Donkey anti-goat AF546	ThermoFisher	A11056
Donkey anti-rabbit AF488	ThermoFisher	A21206
Donkey anti-rabbit AF546	ThermoFisher	A10040
Frozen Section Medium	ThermoFisher	Neg-50	Colorless
Microscope cover glass	Citotest	10212450C
Microtome	Yamato	REM-710
Neurofilament 200	Sigma-Aldrich	N4142	Rabbit
Neurofilament 200	Abcam	ab4680	Chicken
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-12	10 ml
Normal saline	Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd	H37022750	250 ml
Paraformaldehyde	Macklin	P804536	500g
Phalloidin AF350	ThermoFisher	A22281
Precision peristaltic pump	Longer	BT100-2J
S100-β	Abcam	ab52642	Rabbit
Sodium phosphate dbasic dodecahydrate	Macklin	S818118	500g
Sodium phosphate monobasic dihydrate	Macklin	S817463	500g
Sucrose	Macklin	S818046	500g
Superfrost plus microscope slides	ThermoFisher	4951PLUS-001E
Triton X-100	Solarbio Life Sciences	9002-93-1	100 ml
Vesicular Acetylcholine Transporter	Milipore	ANB100	Goat
α-bungarotoxin AF647 conjugate	ThermoFisher	B35450