Ikke-invasiv PET/MR-billeddannelse i en ortopisk musemodel af hepatocellulært karcinom

Summary

Her præsenterer vi en protokol til oprettelse af ortotopiske hepatocellulære carcinomxenotransplantater med og uden leverarterieligering og udfører ikke-invasiv positronemissionstomografi (PET) billeddannelse af tumorhypoxi ved hjælp af [18 F] Fluoromisonidazol ([18 F] FMISO) og [18 F] fluorodeoxyglucose ([¹⁸F] FDG).

Abstract

Prækliniske eksperimentelle modeller af hepatocellulært carcinom (HCC), der rekapitulerer menneskelig sygdom, repræsenterer et vigtigt redskab til at studere tumorigenese og evaluere nye terapeutiske tilgange. Ikke-invasiv helkropsbilleddannelse ved hjælp af positronemissionstomografi (PET) giver kritisk indsigt i vævets in vivo-egenskaber på molekylært niveau i realtid. Vi præsenterer her en protokol for ortotopisk HCC-xenograftdannelse med og uden leverarterieligering (HAL) for at inducere tumorhypoxi og vurderingen af deres tumormetabolisme in vivo ved anvendelse af [18 F] Fluoromisonidazol ([18 F] FMISO) og [18 F] Fluorodeoxyglucose ([¹⁸F] FDG) PET / magnetisk resonans (MR) billeddannelse. Tumorhypoxi kunne let visualiseres ved hjælp af hypoxi-markøren [18 F] FMISO, og det blev fundet, at [18 F] FMISO-optagelsen var højere hos HCC-mus, der gennemgik HAL end i ikke-HAL-gruppen, mens [¹⁸F] FDG ikke kunne skelne tumorhypoxi mellem de to grupper. HAL-tumorer viste også et højere niveau af hypoxi-inducerbar faktor (HIF)-1α-ekspression som reaktion på hypoxi. Kvantificering af HAL-tumorer viste en 2,3 gange stigning i [¹⁸F] FMISO-optagelse baseret på den standardiserede værdioptagelsesmetode (SUV).

Introduction

Hepatocellulært karcinom (HCC) er den sjette mest diagnosticerede kræft og den tredje mest almindelige dødsårsag fra kræft på verdensplan med mere end 900,000 nye tilfælde og 800,000 dødsfald i 2020¹. Den største risikofaktor er skrumpelever, der opstår som følge af virusinfektioner (hepatitis B- og C-vira), alkoholmisbrug, diabetes og ikke-alkoholisk steatohepatitis². Håndteringen af HCC er ret kompleks, og flere behandlingsmuligheder er tilgængelige, herunder kirurgisk resektion, termisk eller kemisk ablation, transplantation, transarteriel kemoembolisering, stråling og kemoterapi, afhængigt af sygdomsstadiet ^2,3. HCC er en kemoterapi-ildfast tumor med sygdomstilbagefald hos op til 70% af patienterne efter helbredende hensigt^{terapi 2}.

På trods af den høje grad af tumorheterogenitet er HCC forbundet med to almindelige resultater: (i) HCC er meget hypoxisk, og (ii) tumorhypoxi er forbundet med større tumoraggressivitet og behandlingssvigt. Den ukontrollerede spredning af HCC-celler resulterer i et højt iltforbrug, der går forud for vaskularisering, hvilket skaber et hypoxisk mikromiljø. Lave intratumorale iltniveauer udløser derefter en række biologiske reaktioner, der påvirker tumoraggressivitet og behandlingsrespons. Hypoxi-inducerbare faktorer (HIF’er) anerkendes ofte som de væsentlige transkriptionelle regulatorer som reaktion på hypoxi ^2,3. Derfor er evnen til at detektere hypoxi afgørende for at visualisere neoplastisk væv og identificere de utilgængelige steder, som kræver invasive procedurer. Det hjælper også til bedre at forstå de molekylære ændringer, der fører til tumoraggressivitet og forbedrer patientbehandlingsresultaterne.

Molekylær billeddannelse ved hjælp af positronemissionstomografi (PET) anvendes almindeligvis til diagnosticering og iscenesættelse af mange kræftformer, herunder HCC. Navnlig kan kombineret anvendelse af dobbeltsporet PET-billeddannelse, der involverer [18 F]fluorodeoxyglucose ([¹⁸F]FDG) og [¹¹C]acetat, øge den samlede følsomhed ved HCC-diagnose ^4,5 betydeligt. Billeddannelse af hypoxi kan derimod opnås ved anvendelse af den almindeligt anvendte hypoxiske markør [18 F]Fluoromisonidazol ([¹⁸F]FMISO). I klinisk praksis er den ikke-invasive vurdering af hypoxi vigtig for at skelne mellem forskellige typer tumorer og regioner til planlægning af strålebehandling⁶.

Præklinisk billeddannelse er blevet et uundværligt værktøj til ikke-invasiv og langsgående evaluering af musemodeller for forskellige sygdomme. En robust og meget reproducerbar HCC-model udgør en vigtig platform for præklinisk og translationel forskning i patofysiologien af humant HCC og vurdering af nye terapier. Sammen med PET-billeddannelse kan in vivo-adfærd belyses for at give vigtig indsigt på molekylært niveau for et givet tidspunkt. Her beskriver vi en protokol til generering af hepatisk arterieligering (HAL) ortopisk HCC-xenotransplantater og analyse af deres in vivo tumormetabolisme ved hjælp af [18 F] FMISO og [¹⁸F] FDG PET / MR. Inkorporeringen af HAL gør en passende model af transgene eller kemisk inducerede HCC-mus xenotransplantater til at studere tumorhypoxxi in vivo, da HAL effektivt kan blokere arteriel blodforsyning for at inducere intratumoral hypoxi ^7,8. I modsætning til ex vivo immunhistokemisk farvning ved anvendelse af pimonidazol kan ændringer i tumormetabolisme som følge af hypoxi desuden let visualiseres og nøjagtigt kvantificeres ikke-invasivt ved hjælp af PET-billeddannelse, hvilket muliggør langsgående vurdering af behandlingsrespons eller måling af fremkomsten af resistens ^3,7,8 . Vores metode, der er vist her, gør det muligt at skabe en robust hypoxisk HCC-model sammen med ikke-invasiv overvågning af tumorhypoxi ved hjælp af PET/MR-billeddannelse til at studere HCC-biologi in vivo.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med Udvalget for Anvendelse af Levende Dyr i Undervisning og Forskning (CULATR) i Center for Komparativ Medicinsk Forskning (CCMR) ved University of Hong Kong, et program akkrediteret af Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). De dyr, der blev anvendt i undersøgelsen, var hunmus med BALB/cAnN-nu (Nøgen) i alderen 6-8 uger, vægtet ved 20 g ± 2 g. Mad og vand blev leveret ad libitum. <p class="jove_title…

Representative Results

For at opnå en passende tumorblok til successiv ortopisk implantation blev stabile kloner først genereret ved subkutan injektion af 200 μL cellesuspension i DPBS (indeholdende MHCC97L-celler) i den nedre flanke af nøgne mus (figur 1A). Tumorvækst blev overvåget, og når tumorstørrelsen nåede 800-1000 mm 3 (ca. 4 uger efter injektion), blev mus aflivet, og den resulterende tumorblok blev skåret i ca. 1 mm3 fragmenter til efterfølgende leverortotopisk implantati…

Discussion

I denne undersøgelse beskrev vi procedurerne for udførelse af HAL på leverortotopiske HCC-xenotransplantater ved hjælp af subkutane tumorer sammen med metoder til ikke-invasiv overvågning af tumorhypoxxxi i ortotopiske xenotransplantater ved hjælp af [18 F] FMISO og [¹⁸F] FDG PET / MR. Vores interesse ligger i metabolisk billeddannelse af forskellige kræft- og sygdomsmodeller til tidlig diagnose og evaluering af behandlingsrespons^11,13,14,15<sup class="xref"…

Materials

0.9% sterile saline	BBraun	N/A	0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL
10# Scalpel blade	RWD Life Science Co.,ltd	S31010-01	Animal surgery tool
10% povidone-iodine solution	Banitore	6.425.678	For disinfection
25G needle with a 1 mL syringe	BD PrecisionGlide	N/A	1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections
5 mL syringe	Terumo	SS05L	5 mL syringe Luer Lock
70% Ethanol	Merck	1.07017	For disinfection
Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAF2000	For automated cell counting
Buprenorphine	HealthDirect	N/A	Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery
Cell Culture Dish (60 mm diameter)	Thermo Scientific	150462	For tumor tissue processing
Centrifuge	Sigma	3-16KL, fixed-angle rotor 12311	For cell suspensions collection
Centrifuge Conical Tube	Eppendorf	EP0030122151	For cell suspensions collection
Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)	Gibco	10566024	high glucose, GlutaMAX™ Supplement
Digital Caliper	RS PRO	841-2518	For subcutaneous tumor size measurement
Direct heat CO2 incubator	Techcomp Limited	NU5841	For cell culture
Dose calibrator	Biodex	N/A	Atomlab 500
DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline)	Gibco	14287072	For cell wash and injection
Eye lubricant	Alcon Duratears	N/A	Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	A4766801	Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines
Forceps (curved fine and straight blunt)	RWD Life Science Co.,ltd	F12012-10 & F12011-13	Animal surgery tool
Heating pad	ALA Scientific Instruments	N/A	Heat pad for mice during surgery
Insulin syringe	Terumo	10ME2913	1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections
InterView fusion software	Mediso	Version 3.03	Post-processing and image analysis software
Inverted microscope	Yu Lung Scientific Co., Ltd	BM-209G	For cells morphology visualization
Isoflurane	Chanelle Pharma	N/A	Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL
Ketamine	Alfasan International B.V.	HK-37715	Ketamine 10% injection solution, 10 mL
Medical oxygen	Linde HKO	101-HR	compressed gas, 99.5% purity
nanoScan PET/MR Scanner	Mediso	N/A	3 Tesla MR
Needle holder	RWD Life Science Co.,ltd	F31026-12	Animal surgery tool
Nucline nanoScan software	Mediso	Version 3.0	Scanner operating software
Nylon Suture (6/0 and 5/0)	Healthy Medical Company Ltd	000524 & 000526	Animal surgery tool
Penicillin- Streptomycin	Gibco	15140122	Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin.
Pentabarbital	AlfaMedic	13003	Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice
Sharp scissors	RWD Life Science Co.,ltd	S14014-10	Animal surgery tool
Spring Scissors	RWD Life Science Co.,ltd	S11005-09	Animal surgery tool
Trypan Blue Solution, 0,4%	Gibco	15250061	For cell counting
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red.	Gibco	25200072	For cell digestion
Xylazine	Alfasan International B.V.	HK-56179	Xylazine 2% injection solution, 30 mL