Samtidig avbildning og flowcytometribasert påvisning av flere fluorescerende senescensmarkører i terapiinduserte senescent kreftceller
Summary
Her presenterer vi en flowcytometribasert metode for visualisering og kvantifisering av multiple senescensassosierte markører i enkeltceller.
Abstract
Kjemoterapeutiske legemidler kan indusere uopprettelig DNA-skade i kreftceller, noe som fører til apoptose eller for tidlig senescens. I motsetning til apoptotisk celledød, er senescence et fundamentalt annet maskineri som begrenser forplantning av kreftceller. Tiår med vitenskapelige studier har avslørt de komplekse patologiske effektene av senescent kreftceller i svulster og mikromiljøer som modulerer kreftceller og stromale celler. Nye bevis tyder på at senescens er en potent prognostisk faktor under kreftbehandling, og derfor er rask og nøyaktig påvisning av senescentceller i kreftprøver avgjørende. Denne artikkelen presenterer en metode for å visualisere og oppdage terapiindusert senescens (TIS) i kreftceller. Diffuse store B-cellelymfom (DLBCL) cellelinjer ble behandlet med mafosfamid (MAF) eller daunorubicin (DN) og undersøkt for senescensmarkør, senescensassosiert β-galaktosidase (SA-β-gal), DNA-syntesemarkør 5-ethynyl-2′-deoksyuridin (EdU) og DNA-skademarkør gamma-H2AX (γH2AX). Flowcytometeravbildning kan bidra til å generere høyoppløselige enkeltcellebilder på kort tid for samtidig å visualisere og kvantifisere de tre markørene i kreftceller.
Introduction
En rekke stimuli kan utløse cellulær senescens, noe som får celler til å gå inn i en tilstand av stabil cellesyklusarrest. Disse stimuli inkluderer inneboende signalendringer eller ekstrinsiske påkjenninger. Intrinsiske signaler inkluderer progressiv telomerforkortelse, endringer i telomerstruktur, epigenetisk modifikasjon, proteostaseforstyrrelser, mitokondriell dysfunksjon og aktivering av onkogener. Ytre påkjenninger inkluderer betennelses- og/eller vevsskadesignaler, stråling eller kjemisk behandling, og næringsdeprivasjon 1,2,3,4. Blant forskjellige typer senescens er de mest sett og godt studerte replikativ senescens, onkogenindusert senescens (OIS), strålingsindusert senescens og terapi-indusert senescens (TIS). OIS er en akutt cellulær respons på gentoksisk skade forårsaket av replikativt stress generert av avvikende onkogenaktivering og kan til en viss grad forhindre den patologiske progresjonen fra en preneoplastisk lesjon til en fullblåst tumor. TIS skjer når tumorceller blir stresset av kjemoterapeutiske legemidler eller ioniserende stråling 5,6.
Senescence regnes som et tveegget sverd i patologi på grunn av sin svært dynamiske natur. Det ble opprinnelig beskrevet som en gunstig tumorundertrykkende mekanisme for å fjerne skadede celler fra det sirkulerende bassenget av delende celler, beskytte organets normale funksjon og hemme tumorvekst 7,8,9. Imidlertid har nye bevis antydet en mørk side av senescence. Senescentceller utskiller proinflammatoriske cytokiner, kjent som senescensassosiert sekretorisk fenotype (SASP), noe som fører til fibrose og funksjonsfeil organer og fremmer tumorinitiering og progresjon10. Videre gjennomgår senescent kreftceller epigenetisk og genuttrykksreprogrammering parallelt med kromatinremodellering og aktivering av en vedvarende DNA-skaderespons (DDR)11,12, nyinnkjøp av nye kreftstamcelleegenskaper3. Selv om senescens-kompatible svulster reagerer bedre på terapeutisk intervensjon sammenlignet med senescence-incapable de13, kan persistensen av senescentceller føre til en dårlig langsiktig prognose hvis de ikke effektivt identifiseres og elimineres av senolytiske legemidler5. Uansett er en pålitelig metode for å vurdere senescens av betydelig klinisk interesse, ikke bare for prognosen for terapibehandling, men også for utvikling av nye strategier rettet mot senescentceller.
Uavhengig av forskjellige utløsere, viser senescentceller noen vanlige trekk, inkludert forstørret, flatt, multinukleær morfologi med store vakuoler, signifikant utvidede kjerner, dannelse av H3K9me3-rik senescensassosiert heterokromatin (SAHF) i kjernen, vedvarende akkumulering av DNA-skademarkør γH2AX foci, aktivert p53-p21CIP1 og Rb-p16INK4a cellesyklusreguleringsmekanismer, stabil G1-cellesyklusarrest, massiv induksjon av SASP og forhøyet senescensassosiert β-galaktosidase (SA-β-gal) aktivitet14. Siden ingen enkelt markør er tilstrekkelig til å definere senescens, kombineres enzymatisk farging for SA-β-gal-aktivitet, som regnes som gullstandarden for senescensdeteksjon, vanligvis med immunhistokjemisk farging for H3K9me3 og Ki67 for å oppdage TIS15. Kjemisk kromogenbasert SA-β-gal er imidlertid vanskelig å kvantifisere. Her kombinerte vi 5-dodekanoylaminofluorescein-di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) fluorescensbasert SA-β-gal (fSA-β-gal) deteksjon med immunfluorescerende farging for γH2AX og EdU-inkorporert DNA for å identifisere C12FDG + EdU-γH2AX + senescentceller ved hjelp av det avanserte imaging flow cytometer-systemet, som kombinerer hastighet, følsomhet og detaljerte enkeltcellebilder med romlig informasjon som ikke kan leveres ved flowcytometri og mikroskopi. Denne metoden muliggjør rask generering av høyoppløselige bilder som muliggjør posisjonering og kvantifisering av fluorescerende signaler i celler, samtidig som den lisensierer rask analyse av flere prøver ved å bygge standard rørledninger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne metoden undersøkte senescens-entering-evnen til fire forskjellige DLBCL-cellelinjer ved kjemoterapibehandling, med lysfeltavbildning og flowcytometribasert kvantifisering. På enkeltcellenivå påviste vi store C12FDG+EdU-Ki67+senescentpopulasjoner i behandlede KARPAS422- og WSU-DLCL2-celler, og i mindre grad i OCI-LY1-celler, mens SU-DHL6-cellelinjen var resistent mot behandlingen. Forskjellen i senescens-entering evne blant cellelinjer kan forklares av deres distinkte …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av et stipend til Yong Yu fra Johannes Kepler University Linz (BERM16108001).
Materials
| Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613407 | |
| Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
| C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | Fisher Scientific | 11590276 | |
| Chloroquin -diphosphat | Sigma aldrich | C6628 | |
| Cleanser (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit | Thermo Scientific | C10418 | |
| Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
| Debubbler (70% Isopropanol) | Millipore | 1.3704 | |
| Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
| Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software) | Luminex | 100220 | |
| KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
| mafosfamide cyclohexylamine | Niomech | D-17272 | |
| OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 11473704 | |
| PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) | Sigma aldrich | P4902 | |
| saponin | Sigma aldrich | 47036 | |
| Sheath | Millipore | BSS-1006-B | |
| SpeedBead Kit for ImageStream | Luminex | 400041 | |
| Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite) | VWR | JT9416-1 | |
| SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
| WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |
References
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Di Micco, R., et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).
- Milanovic, M., et al. Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness. Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).
- Passos, J. F., et al. Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence. Molecular Systems Biology. 6 (1), 347 (2010).
- Lee, S., Schmitt, C. A. The dynamic nature of senescence in cancer. Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).
- Toussaint, O., et al. Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions. The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).
- Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. Cellular senescence in cancer and aging. Cell. 130 (2), 223-233 (2007).
- Munoz-Espin, D., et al. Programmed cell senescence during mammalian embryonic development. Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).
- Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer. Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Chandra, T., et al. Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells. Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).
- Rodier, F., et al. Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion. Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).
- Schleich, K., et al. H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients. Nature Communications. 11 (1), 3651 (2020).
- Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d’Adda di Fagagna, F. Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).
- Fan, D. N., Schmitt, C. A. Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).
- Schmitt, C. A., Lowe, S. W. Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models. Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).
- Dorr, J. R., et al. Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy. Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).
- Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. Genotoxic stress-induced senescence. Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).
- Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
- Biran, A., et al. Quantitative identification of senescent cells in aging and disease. Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).
- Rossi, M., Abdelmohsen, K. The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets. Cells. 10 (7), 1740 (2021).
- Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).
