Tedaviye Bağlı Yaşlanan Kanser Hücrelerinde Çoklu Floresan Yaşlanma Belirteçlerinin Eşzamanlı Görüntüleme ve Akış Sitometrisine Dayalı Tespiti
Summary
Burada, tek hücrelerde çoklu yaşlanma ile ilişkili belirteçlerin görselleştirilmesi ve nicelleştirilmesi için akış sitometrisine dayalı bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Kemoterapötik ilaçlar, kanser hücrelerinde onarılamaz DNA hasarına neden olarak apoptoza veya erken yaşlanmaya neden olabilir. Apoptotik hücre ölümünün aksine, yaşlanma, kanser hücrelerinin yayılmasını kısıtlayan temelde farklı bir makinedir. Onlarca yıllık bilimsel çalışmalar, yaşlanan kanser hücrelerinin tümörlerde ve kanser hücrelerini ve stromal hücreleri modüle eden mikro ortamlarda karmaşık patolojik etkilerini ortaya koymuştur. Yeni kanıtlar, yaşlanmanın kanser tedavisi sırasında güçlü bir prognostik faktör olduğunu ve bu nedenle kanser örneklerinde yaşlanan hücrelerin hızlı ve doğru bir şekilde tespit edilmesinin gerekli olduğunu göstermektedir. Bu yazıda kanser hücrelerinde tedaviye bağlı yaşlanmayı (TIS) görselleştirmek ve saptamak için bir yöntem sunulmaktadır. Diffüz büyük B hücreli lenfoma (DLBCL) hücre hatları mafosfamid (MAF) veya daunorubisin (DN) ile tedavi edildi ve yaşlanma belirteci, yaşlanma ile ilişkili β-galaktosidaz (SA-β-gal), DNA sentez belirteci 5-etinil-2′-deoksiüridin (EdU) ve DNA hasar belirteci gama-H2AX (γH2AX) açısından incelendi. Akış sitometresi görüntüleme, kanser hücrelerindeki üç belirteci aynı anda görselleştirmek ve ölçmek için kısa sürede yüksek çözünürlüklü tek hücreli görüntüler üretmeye yardımcı olabilir.
Introduction
Çeşitli uyaranlar hücresel yaşlanmayı tetikleyebilir ve hücrelerin kararlı bir hücre döngüsü tutuklaması durumuna girmesine neden olabilir. Bu uyaranlar, içsel sinyal değişikliklerini veya dışsal stresleri içerir. İçsel sinyaller arasında ilerleyici telomer kısalması, telomer yapısındaki değişiklikler, epigenetik modifikasyon, proteostaz bozuklukları, mitokondriyal disfonksiyon ve onkogenlerin aktivasyonu sayılabilir. Dışsal stresler arasında enflamatuar ve/veya doku hasarı sinyalleri, radyasyon veya kimyasal tedavi ve beslenme yoksunluğu 1,2,3,4 bulunur. Farklı yaşlanma türleri arasında en sık görülen ve iyi çalışılanlar replikatif yaşlanma, onkogen kaynaklı yaşlanma (OIS), radyasyona bağlı yaşlanma ve tedaviye bağlı yaşlanmadır (TIS). OIS, anormal onkogen aktivasyonu ile oluşan replikatif stresin neden olduğu genotoksik hasara akut hücresel bir yanıttır ve bir dereceye kadar preneoplastik bir lezyondan tam gelişmiş bir tümöre patolojik ilerlemeyi önleyebilir. TIS, tümör hücreleri kemoterapötik ilaçlar veya iyonlaştırıcı radyasyon 5,6 ile strese girdiğinde meydana gelir.
Yaşlanma, son derece dinamik doğası nedeniyle patolojide iki ucu keskin bir kılıç olarak kabul edilir. Başlangıçta, hasarlı hücreleri bölünen hücrelerin dolaşım havuzundan çıkarmak, organların normal işlevini korumak ve tümör büyümesini inhibe etmek için yararlı bir tümör baskılayıcı mekanizma olarak tanımlanmıştır 7,8,9. Bununla birlikte, ortaya çıkan kanıtlar yaşlanmanın karanlık bir tarafını öne sürmüştür. Yaşlanan hücreler, yaşlanma ile ilişkili sekretuar fenotip (SASP) olarak bilinen proinflamatuar sitokinler salgılar, fibroz ve arızalı organlara yol açar ve tümörün başlamasını ve ilerlemesini teşvik eder10. Ayrıca, yaşlanan kanser hücreleri, kromatin yeniden şekillenmesine ve sürekli bir DNA hasarı yanıtının (DDR) aktivasyonuna paralel olarak epigenetik ve gen ekspresyonu yeniden programlamasına tabi tutulur 11,12, yeni kanser-kök hücre özellikleri3. Her ne kadar yaşlanma yeteneğine sahip tümörler yaşlanma yeteneğine sahip olmayanlara kıyasla terapötik müdahaleye daha iyi yanıt verse de13, yaşlanan hücrelerin kalıcılığı, senolitik ilaçlarla etkili bir şekilde tanımlanmadıkları ve elimine edilmedikleri takdirde uzun vadeli prognozun kötü olmasına neden olabilir5. Her iki durumda da, yaşlanmayı değerlendirmek için güvenilir bir yöntem, sadece tedavi tedavisinin prognozu için değil, aynı zamanda yaşlanan hücreleri hedef alan yeni stratejilerin geliştirilmesi için de önemli klinik ilgi çekicidir.
Farklı tetikleyicilerden bağımsız olarak, yaşlanan hücreler, büyük vakuollerle genişlemiş, düzleşmiş, çok çekirdekli morfoloji, önemli ölçüde genişlemiş çekirdekler, çekirdekte H3K9me3 bakımından zengin yaşlanma ile ilişkili heterokromatin (SAHF) oluşumu, DNA hasar belirteci γH2AX odaklarının sürekli birikmesi, aktive edilmiş p53-p21CIP1 ve Rb-p16INK4a gibi bazı ortak özellikler sergiler. hücre döngüsü düzenleyici mekanizmalar, stabil G1 hücre döngüsü arresti, SASP’nin masif indüksiyonu ve yüksek yaşlanma ile ilişkili β-galaktosidaz (SA-β-gal) aktivitesi14. Yaşlanmayı tanımlamak için tek bir belirteç yeterli olmadığından, yaşlanma tespiti için altın standart olarak kabul edilen SA-β-gal aktivitesi için enzimatik boyama, genellikle TIS15’i tespit etmek için H3K9me3 ve Ki67 için immünohistokimyasal boyama ile birleştirilir. Bununla birlikte, kimyasal kromojenik bazlı SA-β-gal’in ölçülmesi zordur. Burada, 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-D-galaktopyranoside (C 12 FDG) floresan bazlı SA-β-gal (fSA-β-gal) tespitini, γH2AX ve EdU-dahil DNA için immünofloresan boyama ile birleştirerek, C 12 FDG + EdU-γH2AX+ yaşlanan hücreleri tanımlamak için hız, duyarlılık ve ayrıntılı tek hücreli görüntüleri akış sitometrisi ve mikroskopi ile sağlanamayan uzamsal bilgilerle birleştirdik. Bu yöntem, hücreler içindeki floresan sinyallerinin konumlandırılmasına ve nicelleştirilmesine izin veren yüksek çözünürlüklü görüntülerin hızlı bir şekilde üretilmesini sağlarken, standart boru hatları oluşturarak birden fazla numunenin hızlı analizini lisanslar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yöntem, kemoterapi tedavisi üzerine dört farklı DLBCL hücre hattının yaşlanma giriş kabiliyetini, parlak alan görüntüleme ve akış sitometrisine dayalı niceleme ile inceledi. Tek hücreli bir düzeyde, tedavi edilen KARPAS422 ve WSU-DLCL2 hücrelerinde ve OCI-LY1 hücrelerinde daha az ölçüde majör C12FDG + EdU-Ki67 + yaşlanan popülasyonları başarıyla tespit ettik, SU-DHL6 hücre hattı tedaviye dirençliydi. Hücre hatları arasındaki yaşlanma giriş…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Linz Johannes Kepler Üniversitesi’nden Yong Yu’ya verilen bir hibe ile desteklenmiştir (BERM16108001).
Materials
| Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody | Biolegend | 613407 | |
| Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647) | Biolegend | 350509 | |
| C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside) | Fisher Scientific | 11590276 | |
| Chloroquin -diphosphat | Sigma aldrich | C6628 | |
| Cleanser (Coulter Clenz) | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit | Thermo Scientific | C10418 | |
| Daunorubicin | Medchemexpress | HY-13062A | |
| Debubbler (70% Isopropanol) | Millipore | 1.3704 | |
| Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3) | Luminex | CN-SW69-12 | |
| Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software) | Luminex | 100220 | |
| KARPAS | DSMZ | ACC 31 | |
| mafosfamide cyclohexylamine | Niomech | D-17272 | |
| OCI-LY1 | DSMZ | ACC 722 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 11473704 | |
| PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid) | Sigma aldrich | P4902 | |
| saponin | Sigma aldrich | 47036 | |
| Sheath | Millipore | BSS-1006-B | |
| SpeedBead Kit for ImageStream | Luminex | 400041 | |
| Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite) | VWR | JT9416-1 | |
| SU-DHL6 | DSMZ | ACC 572 | |
| WSU-DLCL2 | DSMZ | ACC 575 |
References
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Di Micco, R., et al. Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication. Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).
- Milanovic, M., et al. Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness. Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).
- Passos, J. F., et al. Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence. Molecular Systems Biology. 6 (1), 347 (2010).
- Lee, S., Schmitt, C. A. The dynamic nature of senescence in cancer. Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).
- Toussaint, O., et al. Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions. The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).
- Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. Cellular senescence in cancer and aging. Cell. 130 (2), 223-233 (2007).
- Munoz-Espin, D., et al. Programmed cell senescence during mammalian embryonic development. Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).
- Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer. Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Chandra, T., et al. Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells. Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).
- Rodier, F., et al. Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion. Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).
- Schleich, K., et al. H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients. Nature Communications. 11 (1), 3651 (2020).
- Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d’Adda di Fagagna, F. Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).
- Fan, D. N., Schmitt, C. A. Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).
- Schmitt, C. A., Lowe, S. W. Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models. Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).
- Dorr, J. R., et al. Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy. Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).
- Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. Genotoxic stress-induced senescence. Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).
- Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
- Biran, A., et al. Quantitative identification of senescent cells in aging and disease. Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).
- Rossi, M., Abdelmohsen, K. The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets. Cells. 10 (7), 1740 (2021).
- Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).
