初代培養における分化マウス脂肪細胞:インスリン抵抗性のモデル
Summary
このプロトコルは、皮下脂肪からのマウス前駆脂肪細胞の単離、成熟脂肪細胞への分化、およびインスリン抵抗性の誘導について説明しています。インスリン作用は、ウェスタンブロットを介したインスリンシグナル伝達経路のメンバーのリン酸化/活性化によって評価されます。この方法は、初代脂肪細胞におけるインスリン抵抗性/感受性の直接決定を可能にする。
Abstract
インスリン抵抗性は、その標的細胞に対するインスリンの減少した効果であり、通常、インスリン受容体シグナル伝達の減少に由来する。インスリン抵抗性は、2型糖尿病(T2D)および世界中で有病率の高い他の肥満由来の疾患の発症に寄与しています。したがって、インスリン抵抗性の根底にあるメカニズムを理解することは非常に重要です。いくつかのモデルは、 インビボ と インビトロの両方でインスリン抵抗性を研究するために使用されています。初代脂肪細胞は、インスリン抵抗性のメカニズムを研究し、この状態とインスリン感作薬の分子標的に対抗する分子を特定するための魅力的な選択肢です。ここでは、腫瘍壊死因子α(TNF-α)で処理した培養中の初代脂肪細胞を用いたインスリン抵抗性モデルを確立しました。
磁気細胞分離技術によってコラゲナーゼ消化されたマウス皮下脂肪組織から分離された脂肪細胞前駆細胞(APC)は、初代脂肪細胞に分化します。インスリン抵抗性は、インスリンシグナル伝達カスケードのメンバーのチロシンリン酸化/活性化を低下させる炎症誘発性サイトカインであるTNF-αによる治療によって誘導されます。インスリン受容体(IR)、インスリン受容体基質(IRS-1)、およびプロテインキナーゼB(AKT)のリン酸化の減少は、ウェスタンブロットによって定量されます。この方法は、脂肪組織におけるインスリン抵抗性を媒介するメカニズムを研究するための優れたツールを提供します。
Introduction
インスリンは、膵島β細胞によって産生される同化ホルモンであり、グルコースおよび脂質代謝の重要な調節因子です。その多くの機能の中で、インスリンはグルコース取り込み、グリコーゲン合成、糖新生、タンパク質合成、脂質生成、および脂肪分解を調節します1。インスリンとその受容体(IR)との相互作用後の初期分子シグナルは、IR2の固有のチロシンタンパク質キナーゼ活性の活性化であり、その結果、その自己リン酸化3と、その後のインスリン受容体基質(IRS)として知られるタンパク質ファミリーの活性化が起こり、アダプタータンパク質に結合してプロテインキナーゼのカスケードの活性化につながります4.インスリンは、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ(PI3K)-プロテインキナーゼB(AKT)とRas-マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)の2つの主要なシグナル伝達経路を活性化します。前者は、燃料恒常性の調節を含む多様な生理学的機能に関与する多数の下流エフェクターの活性化のための主要な分岐点またはノード4,5を構成し、後者は細胞の成長と分化を調節します4,6。インスリン作用は、最終的に細胞型および生理学的状況に依存する7。
主なインスリン応答性代謝組織の1つは脂肪組織です。白色脂肪組織は、ヒトおよびげっ歯類において最も豊富なタイプの脂肪であり、皮下脂肪(皮膚と筋肉の間)および内臓脂肪(腹腔内の臓器の周囲)に分布する。それらの大量を考えると、脂肪細胞または脂肪細胞は脂肪組織において最も豊富な細胞型である。これらの脂肪細胞は、茶色/ベージュ(熱発生性)、ピンク(乳腺内)、および白8,9です。白色脂肪細胞は、インスリン依存性プロセスであるトリグリセリドの形で体内の主要なエネルギー貯蔵を維持します。インスリンはグルコース輸送と脂質生成を促進しますが、脂肪分解または脂質分解を阻害します7,10。また、脂肪前駆細胞の脂肪細胞(成熟脂肪貯蔵細胞)への分化を促進します11。
インスリン抵抗性は、正常なインスリンレベルが弱毒化された生物学的応答を引き起こし、代償性高インスリン血症をもたらすときに発生します12。インスリン抵抗性は、過体重および肥満5に関連する状態であり、組み合わせると2型糖尿病(T2D)および他の代謝性疾患13につながる。高インスリン血症は、末梢組織のインスリン抵抗性を補い、正常な血糖値を維持します14。しかし、最終的なβ細胞の喪失または枯渇は、インスリン抵抗性の悪化とともに、T2D5と一致する血糖値の上昇につながります。したがって、インスリン抵抗性および高インスリン血症は、肥満由来の代謝性疾患の発症に寄与し得る15。さらに、肥満は、脂肪組織におけるインスリン抵抗性を促進する慢性的な低悪性度の局所炎症を引き起こし得る15、16、17。さらに、線維症、炎症、血管新生および脂肪生成の減少などの脂肪組織の肥満由来の変化は、アディポネクチン血清レベルの低下(インスリン抵抗性改善剤)およびプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤1(PAI-1)、遊離脂肪酸、および血流へのエキソソームなどの因子の分泌の増加をもたらし、インスリン抵抗性を悪化させる17。
インスリン抵抗性の根底にある多くの側面は不明のままです。脂肪組織を含む主要な標的組織におけるインスリン抵抗性を媒介するメカニズムを研究するために、インビトロおよびインビボモデルが開発されました。in vitroモデルの利点は、研究者が環境条件をより細かく制御でき、特定の細胞タイプのインスリン抵抗性を評価できることです。特に、脂肪細胞前駆細胞(APC)は、ドナー組織の個々の表現型を有し、脂肪細胞株よりも生理機能をよりよく反映している可能性がある。インビトロでインスリン抵抗性を誘導する主な因子は、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)である。TNF−αは、脂肪組織18において脂肪細胞およびマクロファージによって分泌される炎症誘発性サイトカインである。適切な脂肪組織のリモデリングと拡張に必要ですが19、TNF-αへの長期曝露は、in vivoの脂肪組織およびin vitroの脂肪細胞にインスリン抵抗性を誘導します20。いくつかの細胞型の慢性TNF-α治療は、IRおよびIRS-1の両方のセリンリン酸化の増加をもたらし、それによってチロシンリン酸化の減少を促進する21。セリン残基に対するIRS-1のリン酸化の増加は、IRチロシンキナーゼ活性を阻害し、慢性TNF-α治療がインスリン作用を損なう重要なメカニズムの1つである可能性があります22,23。TNF-αは、核内因子ĸBキナーゼβ(IKKβ)およびc-Jun N末端キナーゼ(JNK)のセリン/スレオニンキナーゼ阻害剤を含む経路を活性化します24。JNKは複雑な炎症誘発性転写プログラムを誘導しますが、IRS-16を直接リン酸化します。
インスリン抵抗性の病因を理解することは、T2Dに対する将来の治療法の開発を導くためにますます重要になっています。APCは、インスリンに対する感受性と耐性を含む脂肪細胞生物学の研究、および全身環境とは無関係に脂肪細胞の固有の特性を特定するための優れたモデルであることが証明されています。APCは、異なる脂肪デポから容易に得ることができ、適切な条件下で、成熟脂肪細胞に分化することができる。この方法では、脂肪細胞におけるインスリン抵抗性/感受性への直接的な影響を評価することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この論文は、TNF-αで処理した培養で初代脂肪細胞を使用するインスリン抵抗性を研究するための方法を提供します。このモデルには、初代脂肪細胞を、細胞環境因子を厳密に制御しながら、定義された条件下で長期間培養できるという利点があります26。アッセイ期間は15〜20日であるが、分化した脂肪細胞の割合の変動は実験間で起こり得る。初代脂肪細胞は、培養中に継?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ダニエル・モンドラゴン、アントニオ・プラド、フェルナンド・ロペス・バレラ、マルティン・ガルシア・セルビン、アレハンドラ・カスティーリャ、マリア・アントニエタ・カルバホの技術支援、そして原稿を批判的に編集してくれたジェシカ・ゴンザレス・ノリスに感謝します。このプロトコルは、メキシコ国立技術協会(CONACYT)、教育助成金284771(Y.M.)によってサポートされました。
Materials
| 1. Isolation mouse adipocyte precursor cells | |||
| ACK lysing buffer | LONZA | 10-548E | |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi | 130-090-485 | |
| Anti-CD31 | eBioscience | 13-0311-85 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | ||
| Basement membrane matrix (matrigel) | Corning | 354234 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | Growth factor |
| BSA | Equitech-Bio, Inc. | BAC63-1000 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) – Biotin | eBioscience | 13-0451-85 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochem | LS004197 | |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | |
| DMEM | GIBCO | 12800017 | |
| DMEM low glucose | GIBCO | 31600-034 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Growth factor |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| ITS mix | Sigma | I3146 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Growth factor |
| Linoleic acid-albumin | Sigma | L9530 | |
| MCDB 201 medium | Sigma | M6770 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| PDGF-BB | Peprotech | 315-18 | Growth factor |
| Peniciline-Streptomycine | BioWest | L0022-100 | |
| Pre-Separation Filters (70 µm) | Miltenyi | 130-095-823 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO | 25300062 | |
| 2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction | |||
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX] | Sigma | I5879 | Differentiation cocktail |
| BMP4 | R&D Systems | 5020-BP-010 | Differentiation cocktail |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Differentiation cocktail |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Rosiglitazone | Cayman | 71742 | Differentiation cocktail |
| TNFα | R&D Systems | 210-TA-005 | |
| 3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot | |||
| Anti-beta tubulin antibody | Abcam | ab6046 | |
| Bromophenol blue | BioRad | 161-0404 | Laemmli buffer |
| EDTA | Sigma | E5134 | RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E4378 | RIPA buffer |
| FluorChem E system | ProteinSimple | ||
| Glycerol | Sigma | G6279 | Laemmli buffer |
| Glycine | Sigma | G7126 | Running and Transfer buffer |
| Igepal | Sigma | I3021 | RIPA buffer |
| 2- mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Laemmli buffer |
| Methanol | JT Baker | 907007 | Transfer buffer |
| NaCl | JT Baker | 3624-05 | TBS-T |
| NaF | Sigma | 77F-0379 | RIPA buffer |
| NaOH | JT Baker | 3722-19 | |
| Na4P2O7 | Sigma | 114F-0762 | RIPA buffer |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | RIPA buffer |
| Nitrocellulose membrane | BioRad | 1620112 | |
| Nonfat dry milk | BioRad | 1706404 | Blocking solution |
| Prestained protein standard | BioRad | 1610395 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-5ML | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-132 | |
| Phospho- Insulin Receptor β | Cell signaling | 3024 | |
| Phospho-Akt (Ser473) Antibody | Cell signaling | 9271 | |
| Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody | Millipore | 9432 | |
| Saccharose | JT Baker | 407205 | RIPA buffer |
| SDS | BioRad | 1610302 | Running and laemmli buffer |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| Tris-base | Promega | H5135 | Running, transfer and laemmli buffer |
| Tris-HCl | JT Baker | 4103-02 | RIPA buffer – TBS |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | TBS-T |
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