Differensierte museadipocytter i primærkultur: En modell av insulinresistens
Summary
Denne protokollen beskriver isolering av preadipocytter fra mus fra subkutant fett, deres differensiering i modne adipocytter og induksjon av insulinresistens. Insulinvirkningen evalueres ved fosforylering/aktivering av medlemmer av insulinsignalveien gjennom western blot. Denne metoden tillater direkte bestemmelse av insulinresistens/følsomhet i primære adipocytter.
Abstract
Insulinresistens er en redusert effekt av insulin på målcellene, vanligvis avledet fra redusert insulinreseptorsignalering. Insulinresistens bidrar til utvikling av diabetes type 2 (T2D) og andre fedmeavledede sykdommer med høy prevalens over hele verden. Derfor er forståelse av mekanismene bak insulinresistens av stor relevans. Flere modeller har blitt brukt til å studere insulinresistens både in vivo og in vitro; Primære adipocytter representerer et attraktivt alternativ for å studere mekanismene for insulinresistens og identifisere molekyler som motvirker denne tilstanden og de molekylære målene for insulinsensibiliserende legemidler. Her har vi etablert en insulinresistensmodell ved bruk av primære adipocytter i kultur behandlet med tumornekrosefaktor-α (TNF-α).
Adipocytter forløper celler (APCs), isolert fra kollagenase-fordøyd mus subkutant fettvev ved magnetisk celle separasjon teknologi, er differensiert i primære adipocytter. Insulinresistens induseres deretter ved behandling med TNF-α, et proinflammatorisk cytokin som reduserer tyrosinfosforylering/aktivering av medlemmer av insulinsignalkaskaden. Redusert fosforylering av insulinreseptor (IR), insulinreseptorsubstrat (IRS-1) og proteinkinase B (AKT) kvantifiseres av western blot. Denne metoden gir et utmerket verktøy for å studere mekanismene som medierer insulinresistens i fettvev.
Introduction
Insulin er et anabole hormon produsert av bukspyttkjertelen holme β-celler og nøkkelen regulator av glukose og lipid metabolisme. Blant de mange funksjonene regulerer insulin glukoseopptak, glykogensyntese, glukoneogenese, proteinsyntese, lipogenese og lipolyse1. Det første molekylære signalet etter insulininteraksjon med reseptoren (IR) er aktiveringen av den inneboende tyrosinproteinkinaseaktiviteten til IR2, noe som resulterer i dens autofosforylering3 og den påfølgende aktiveringen av en familie av proteiner kjent som insulinreseptorsubstrater (IRS), som binder seg til adaptorproteiner som fører til aktivering av en kaskade av proteinkinaser4 . Insulin aktiverer to hovedsignalveier: fosfatidylinositol-3-kinase (PI3K)-proteinkinase B (AKT) og Ras-mitogenaktivert proteinkinase (MAPK). Den førstnevnte utgjør et hovedgrenpunkt eller node 4,5 for aktivering av mange nedstrøms effektorer involvert i ulike fysiologiske funksjoner, inkludert regulering av drivstoffhomeostase, mens sistnevnte regulerer cellevekst og differensiering 4,6. Insulinvirkninger avhenger til slutt av celletype og fysiologisk kontekst7.
Et av de viktigste insulinresponsive metabolske vevene er fettvevet. Hvitt fettvev er den mest tallrike typen fett hos mennesker og gnagere, fordelt på subkutant fett (mellom hud og muskler) og visceralt fett (rundt organene i bukhulen). Gitt deres store volum er adipocytter eller fettceller den mest tallrike celletypen i fettvev. Disse fettcellene kan være brune/beige (termogene), rosa (i brystkjertelen) og hvite 8,9. Hvite adipocytter holder de viktigste energireserver i kroppen i form av triglyserider, en insulinavhengig prosess. Insulin fremmer glukosetransport og lipogenese, mens det hemmer lipolyse eller lipidnedbrytning 7,10. Det letter også differensieringen av preadipocytter i adipocytter – de modne fettlagrende cellene11.
Insulinresistens oppstår når et normalt insulinnivå gir en svekket biologisk respons, noe som resulterer i kompenserende hyperinsulinemi12. Insulinresistens er en tilstand assosiert med overvekt og fedme5, som når kombinert fører til type 2 diabetes (T2D) og andre metabolske sykdommer13. Hyperinsulinemi kompenserer insulinresistens i perifert vev for å opprettholde normale blodsukkernivåer14. Eventuelt tap eller utmattelse av β celler, sammen med forverret insulinresistens, fører imidlertid til forhøyede blodsukkernivåer forenlig med T2D5. Derfor kan insulinresistens og hyperinsulinemi bidra til utvikling av fedme-avledede metabolske sykdommer15. Videre kan fedme forårsake kronisk lavgradig lokal betennelse som fremmer insulinresistens i fettvev15,16,17. I tillegg fører fedme-avledede endringer i fettvev, som fibrose, betennelse og redusert angiogenese og adipogenese, til lavere adiponektin serumnivåer (en insulinsensibilisator) og økt sekresjon av faktorer som plasminogenaktivatorinhibitor 1 (PAI-1), frie fettsyrer og eksosomer i blodet, forverrer insulinresistens17.
Mange aspekter som ligger til grunn for insulinresistens forblir ukjente. In vitro og in vivo modeller er utviklet for å studere mekanismene som medierer insulinresistens i viktige målvev, inkludert fettvev. Fordelen med in vitro-modeller er at forskerne har mer kontroll over miljøforholdene og kan evaluere insulinresistens i bestemte celletyper. Spesielt har adipocyttforløperceller (APCer) den individuelle fenotypen til donorvevet, noe som kan reflektere fysiologi bedre enn adipocyttcellelinjer. En hovedfaktor som induserer insulinresistens in vitro er tumornekrosefaktor-α (TNF-α). TNF-α er et proinflammatorisk cytokin som skilles ut av adipocytter og makrofager i fettvev18. Selv om det er nødvendig for riktig remodellering og ekspansjon av fettvev19, induserer langvarig eksponering for TNF-α insulinresistens i fettvev in vivo og i adipocytter in vitro20. Kronisk TNF-α-behandling av flere celletyper fører til økt serinfosforylering av både IR og IRS-1, og fremmer dermed redusert tyrosinfosforylering21. Økt fosforylering av IRS-1 på serinrester hemmer IR-tyrosinkinaseaktiviteten og kan være en av nøkkelmekanismene som kronisk TNF-α-behandling svekker insulinvirkningen22,23. TNF-α aktiverer veier som involverer serin/treoninkinasehemmeren av nukleær faktor ĸB kinase β (IKKβ) og c-Jun N terminal kinase (JNK)24. JNK induserer et komplekst proinflammatorisk transkripsjonsprogram, men også direkte fosforylerer IRS-16.
Å forstå patogenesen av insulinresistens har blitt stadig viktigere for å veilede utviklingen av fremtidige terapier mot T2D. APCer har vist seg å være en utmerket modell for studier av fettcellebiologi, inkludert følsomhet og motstand mot insulin, og for å identifisere de inneboende egenskapene til adipocytter uavhengig av det systemiske miljøet. APCer kan enkelt fås fra forskjellige fettdepoter, og under passende forhold, differensiert til modne adipocytter. Med denne metoden kan direkte effekter på insulinresistens/sensitivitet evalueres i adipocytter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne artikkelen gir en metode for å studere insulinresistens som bruker primære adipocytter i kultur behandlet med TNF-α. Denne modellen har fordelen at primære adipocytter kan dyrkes under definerte forhold i lange perioder med tett kontroll av cellulære miljøfaktorer26. Analysens varighet er 15-20 dager, selv om variasjoner i prosentandelen differensierte adipocytter kan forekomme mellom eksperimenter. Primære adipocytter har fordeler i forhold til cellelinjer siden de ikke har blitt kon…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla og María Antonieta Carbajo for deres tekniske assistanse, og Jessica Gonzalez Norris for kritisk redigering av manuskriptet. Denne protokollen ble støttet av Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (til Y.M.).
Materials
| 1. Isolation mouse adipocyte precursor cells | |||
| ACK lysing buffer | LONZA | 10-548E | |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi | 130-090-485 | |
| Anti-CD31 | eBioscience | 13-0311-85 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | ||
| Basement membrane matrix (matrigel) | Corning | 354234 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | Growth factor |
| BSA | Equitech-Bio, Inc. | BAC63-1000 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) – Biotin | eBioscience | 13-0451-85 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochem | LS004197 | |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | |
| DMEM | GIBCO | 12800017 | |
| DMEM low glucose | GIBCO | 31600-034 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Growth factor |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| ITS mix | Sigma | I3146 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Growth factor |
| Linoleic acid-albumin | Sigma | L9530 | |
| MCDB 201 medium | Sigma | M6770 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| PDGF-BB | Peprotech | 315-18 | Growth factor |
| Peniciline-Streptomycine | BioWest | L0022-100 | |
| Pre-Separation Filters (70 µm) | Miltenyi | 130-095-823 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO | 25300062 | |
| 2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction | |||
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX] | Sigma | I5879 | Differentiation cocktail |
| BMP4 | R&D Systems | 5020-BP-010 | Differentiation cocktail |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Differentiation cocktail |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Rosiglitazone | Cayman | 71742 | Differentiation cocktail |
| TNFα | R&D Systems | 210-TA-005 | |
| 3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot | |||
| Anti-beta tubulin antibody | Abcam | ab6046 | |
| Bromophenol blue | BioRad | 161-0404 | Laemmli buffer |
| EDTA | Sigma | E5134 | RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E4378 | RIPA buffer |
| FluorChem E system | ProteinSimple | ||
| Glycerol | Sigma | G6279 | Laemmli buffer |
| Glycine | Sigma | G7126 | Running and Transfer buffer |
| Igepal | Sigma | I3021 | RIPA buffer |
| 2- mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Laemmli buffer |
| Methanol | JT Baker | 907007 | Transfer buffer |
| NaCl | JT Baker | 3624-05 | TBS-T |
| NaF | Sigma | 77F-0379 | RIPA buffer |
| NaOH | JT Baker | 3722-19 | |
| Na4P2O7 | Sigma | 114F-0762 | RIPA buffer |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | RIPA buffer |
| Nitrocellulose membrane | BioRad | 1620112 | |
| Nonfat dry milk | BioRad | 1706404 | Blocking solution |
| Prestained protein standard | BioRad | 1610395 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-5ML | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-132 | |
| Phospho- Insulin Receptor β | Cell signaling | 3024 | |
| Phospho-Akt (Ser473) Antibody | Cell signaling | 9271 | |
| Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody | Millipore | 9432 | |
| Saccharose | JT Baker | 407205 | RIPA buffer |
| SDS | BioRad | 1610302 | Running and laemmli buffer |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| Tris-base | Promega | H5135 | Running, transfer and laemmli buffer |
| Tris-HCl | JT Baker | 4103-02 | RIPA buffer – TBS |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | TBS-T |
References
- Elmus, G. B. Insulin signaling and insulin resistance. Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).
- Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system. Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).
- Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. R. Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit of its own receptor. Science. 215 (4529), 185-187 (1982).
- Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 85-96 (2006).
- Insulin Resistance. StatPearls Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/ (2021)
- Petersen, M. C., Shulm, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
- Batista, T. M., Haider, N., Kahn, C. R. Defining the underlying defect in insulin action in type 2 diabetes. Diabetologia. 64 (5), 994-1006 (2021).
- Unamuno, X., Frühbeck, G., Catalán, V. Adipose Tissue. Encyclopedia of Endocrine Diseases. Second edition. , 370-384 (2019).
- Cinti, S. Pink adipocytes. Trends in Endocrinology & Metabolism. 29 (9), 651-666 (2018).
- Kahn, B. B., Flier, J. S. Obesity and insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 106 (4), 473-481 (2000).
- Klemm, D. J., et al. Insulin-induced adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 276 (30), 28430-28435 (2001).
- Wilcox, G. Insulin and insulin resistance. The Clinical Biochemist. Reviews. 26 (2), 19-39 (2005).
- Yohannes, T. W. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 13, 3611-3616 (2020).
- James, D. E., Stöckli, J., Birnbaum, M. J. The etiology and molecular landscape of insulin resistance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (11), 751-771 (2021).
- Wondmkun, Y. T. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrime and Obesity: Targets and Therapy. 9 (13), 3611-3616 (2020).
- Hardy, O. T., Czech, M. P., Corvera, S. What causes the insulin resistance underlying obesity. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 19 (2), 81-87 (2012).
- Klein, S., Gastaldelli, A., Yki-Järvinen, H., Scherer, P. E. Why does obesity cause diabetes. Cell Metabolism. 34 (1), 11-20 (2022).
- Lo, K., et al. Analysis of in vitro insulin-resistance models and their physiological relevance to in vivo diet-induced adipose insulin resistance. Cell Reports. 5 (1), 259-270 (2013).
- Asterholm, I. W., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Murray, D. L., Choy, L. N., Spiegelman, B. M. Tumor necrosis factor alpha inhibits signaling from the insulin receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (11), 4854-4858 (1994).
- Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Parijs, L. V., Lodish, H. F. Tumor necrosis factor-α suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes. Nuclear factor-κB activation by TNF-α is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 009191 (2014).
- Hotamisligil, G. S., et al. IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-alpha- and obesity-induced insulin resistance. Science. 271 (5249), 665-668 (1996).
- Copps, K. D., White, M. F. Regulation of insulin sensitivity by serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate proteins IRS1 and IRS2. Diabetologia. 55 (10), 2565-2582 (2012).
- Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).
- Skurk, T., Hauner, H. Primary culture of human adipocyte precursor cells: expansion and differentiation. Methods in Molecular Biology. 806, 215-226 (2012).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 456, 201-219 (2008).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Hausman, D. B., DiGirolamo, M., Bartness, T. J., Hausman, G. J., Martin, R. J. The biology of white adipocyte proliferation. Obesity Reviews. 2 (4), 239-254 (2001).
- Kirkland, I. M., Tchkonia, T., Pirtskhalava, T., Han, J., Karagiannides, I. Adipogenesis and aging: does aging make fat go MAD. Experimental Geronotology. 37 (6), 757-767 (2002).
- Guo, W., et al. Aging results in paradoxical susceptibility of fat cell progenitors to lipotoxicity. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (4), 1041-1051 (2007).
- Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Van Parijs, L., Lodish, H. F.Tumor necrosis factor-a suppresses adipocyte-specific genes and activatesexpression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNF-a is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
- Jager, J., Gre ́meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. Interleukin-1b-induced insulin resistance in adipocytes throughdown-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Rotter, V., Nagaev, I., Smith, U. Interleukin-6 (IL-6) induces insulinresistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor-a,overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects. The Journal of Biological Chemistry. 278 (46), 45777-45784 (2003).
- Isidor, M. S., et al. Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes. International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).
- Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
