Adipociti di topo differenziati in coltura primaria: un modello di insulino-resistenza

Summary

Questo protocollo descrive l’isolamento dei preadipociti di topo dal grasso sottocutaneo, la loro differenziazione in adipociti maturi e l’induzione della resistenza all’insulina. L’azione dell’insulina viene valutata mediante fosforilazione/attivazione dei membri della via di segnalazione dell’insulina attraverso il western blot. Questo metodo consente la determinazione diretta della resistenza/sensibilità all’insulina negli adipociti primari.

Abstract

La resistenza all’insulina è un effetto ridotto dell’insulina sulle sue cellule bersaglio, di solito derivato dalla diminuzione della segnalazione del recettore dell’insulina. La resistenza all’insulina contribuisce allo sviluppo del diabete di tipo 2 (T2D) e di altre malattie derivate dall’obesità ad alta prevalenza in tutto il mondo. Pertanto, comprendere i meccanismi alla base della resistenza all’insulina è di grande rilevanza. Diversi modelli sono stati utilizzati per studiare la resistenza all’insulina sia in vivo che in vitro; Gli adipociti primari rappresentano un’opzione interessante per studiare i meccanismi di insulino-resistenza e identificare le molecole che contrastano questa condizione e i bersagli molecolari dei farmaci insulino-sensibilizzanti. Qui, abbiamo stabilito un modello di insulino-resistenza utilizzando adipociti primari in coltura trattata con fattore di necrosi tumorale α (TNF-α).

Le cellule precursori degli adipociti (APC), isolate dal tessuto adiposo sottocutaneo sottocutaneo di topo digerito con collagenasi mediante tecnologia di separazione cellulare magnetica, sono differenziate in adipociti primari. La resistenza all’insulina viene quindi indotta dal trattamento con TNF-α, una citochina proinfiammatoria che riduce la fosforilazione/attivazione della tirosina dei membri della cascata di segnalazione dell’insulina. La diminuzione della fosforilazione del recettore dell’insulina (IR), del substrato del recettore dell’insulina (IRS-1) e della proteina chinasi B (AKT) è quantificata dal western blot. Questo metodo fornisce un ottimo strumento per studiare i meccanismi che mediano l’insulino-resistenza nel tessuto adiposo.

Introduction

L’insulina è un ormone anabolizzante prodotto dalle cellule β delle isole pancreatiche e il regolatore chiave del metabolismo del glucosio e dei lipidi. Tra le sue numerose funzioni, l’insulina regola l’assorbimento del glucosio, la sintesi del glicogeno, la gluconeogenesi, la sintesi proteica, la lipogenesi e la lipolisi¹. Il segnale molecolare iniziale dopo l’interazione dell’insulina con il suo recettore (IR) è l’attivazione dell’attività intrinseca della proteina chinasi tirosina di IR², con conseguente autofosforilazione³ e successiva attivazione di una famiglia di proteine note come substrati del recettore dell’insulina (IRS), che si lega alle proteine adattatrici portando all’attivazione di una cascata di protein chinasi⁴ . L’insulina attiva due principali vie di segnalazione: fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K)-proteina chinasi B (AKT) e Ras-mitogen-activated protein chinasi (MAPK). Il primo costituisce un importante punto di diramazione o nodo ^4,5 per l’attivazione di numerosi effettori a valle coinvolti in diverse funzioni fisiologiche, tra cui la regolazione dell’omeostasi del combustibile, mentre il secondo regola la crescita e la differenziazione cellulare ^4,6. Le azioni dell’insulina dipendono in ultima analisi dal tipo di cellula e dal contesto fisiologico⁷.

Uno dei principali tessuti metabolici insulino-sensibili è il tessuto adiposo. Il tessuto adiposo bianco è il tipo di grasso più abbondante nell’uomo e nei roditori, distribuito all’interno del grasso sottocutaneo (tra la pelle e i muscoli) e del grasso viscerale (intorno agli organi nella cavità addominale). Dato il loro grande volume, gli adipociti o le cellule adipose sono il tipo di cellula più abbondante nel tessuto adiposo. Queste cellule adipose possono essere marroni / beige (termogeniche), rosa (nella ghiandola mammaria) e bianco ^8,9. Gli adipociti bianchi mantengono le principali riserve energetiche nel corpo sotto forma di trigliceridi, un processo insulino-dipendente. L’insulina favorisce il trasporto del glucosio e la lipogenesi, mentre inibisce la lipolisi o la degradazione dei lipidi ^7,10. Facilita anche la differenziazione dei preadipociti in adipociti – le cellule mature che immagazzinano il grasso¹¹.

La resistenza all’insulina si verifica quando un livello normale di insulina produce una risposta biologica attenuata, con conseguente iperinsulinemia compensatoria¹². La resistenza all’insulina è una condizione associata a sovrappeso e obesità⁵, che quando combinata porta al diabete di tipo 2 (T2D) e ad altre malattie metaboliche¹³. L’iperinsulinemia compensa la resistenza all’insulina nei tessuti periferici per mantenere normali livelli di glucosio nel sangue¹⁴. Tuttavia, l’eventuale perdita o esaurimento delle cellule β, insieme all’esacerbata resistenza all’insulina, porta a livelli elevati di glucosio nel sangue coerenti con T2D⁵. Pertanto, l’insulino-resistenza e l’iperinsulinemia possono contribuire allo sviluppo di malattie metaboliche derivate dall’obesità¹⁵. Inoltre, l’obesità può causare infiammazione locale cronica di basso grado promuovendo la resistenza all’insulina nel tessuto adiposo^15,16,17. Inoltre, le alterazioni derivate dall’obesità nel tessuto adiposo, come la fibrosi, l’infiammazione e la riduzione dell’angiogenesi e dell’adipogenesi, portano a livelli sierici di adiponectina più bassi (un sensibilizzante dell’insulina) e ad un aumento della secrezione di fattori come l’inibitore dell’attivatore del plasminogeno 1 (PAI-1), acidi grassi liberi ed esosomi nel flusso sanguigno, esacerbando la resistenza all’insulina¹⁷.

Molti aspetti alla base della resistenza all’insulina rimangono sconosciuti. Sono stati sviluppati modelli in vitro e in vivo per studiare i meccanismi che mediano la resistenza all’insulina nei principali tessuti bersaglio, incluso il tessuto adiposo. Il vantaggio dei modelli in vitro è che i ricercatori hanno un maggiore controllo delle condizioni ambientali e possono valutare la resistenza all’insulina de specifici tipi di cellule. In particolare, le cellule precursori degli adipociti (APC) hanno il fenotipo individuale del tessuto donatore, che potrebbe riflettere meglio la fisiologia rispetto alle linee cellulari adipocitarie. Uno dei principali fattori che inducono insulino-resistenza in vitro è il fattore di necrosi tumorale α (TNF-α). Il TNF-α è una citochina proinfiammatoria secreta dagli adipociti e dai macrofagi nel tessuto adiposo¹⁸. Mentre è necessario per il corretto rimodellamento ed espansione del tessuto adiposo¹⁹, l’esposizione a lungo termine al TNF-α induce insulino-resistenza nel tessuto adiposo in vivo e negli adipociti in vitro²⁰. Il trattamento cronico con TNF-α di diversi tipi cellulari porta ad un aumento della fosforilazione della serina sia di IR che di IRS-1, promuovendo così una diminuzione della fosforilazione della tirosina²¹. L’aumento della fosforilazione di IRS-1 sui residui di serina inibisce l’attività della tirosin-chinasi IR e può essere uno dei meccanismi chiave attraverso i quali il trattamento cronico con TNF-α altera l’azione dell’insulina^22,23. Il TNF-α attiva vie che coinvolgono l’inibitore della serina/treonina chinasi del fattore nucleare ĸB chinasi β (IKKβ) e della chinasi terminale c-Jun N (JNK)²⁴. JNK induce un complesso programma trascrizionale proinfiammatorio ma fosforila direttamente IRS-1⁶.

Comprendere la patogenesi dell’insulino-resistenza è diventato sempre più importante per guidare lo sviluppo di future terapie contro il T2D. Le APC hanno dimostrato di essere un modello eccellente per lo studio della biologia delle cellule adipose, compresa la sensibilità e la resistenza all’insulina, e per identificare le proprietà intrinseche degli adipociti indipendenti dall’ambiente sistemico. Le APC possono essere facilmente ottenute da diversi depositi adiposi e, nelle condizioni appropriate, differenziate in adipociti maturi. Con questo metodo, gli effetti diretti sulla resistenza/sensibilità all’insulina possono essere valutati negli adipociti.

Protocol

Tutti gli esperimenti sui roditori sono stati approvati dal Comitato di Bioetica dell’Istituto di Neurobiologia dell’UNAM, numero di protocollo 075. 1. Isolamento delle cellule precursori degli adipociti di topo Eutanasia di topi maschi C57BL/6 di 8-10 settimane (ad esempio, per inalazione di CO2 e successiva lussazione cervicale) (quattro animali per isolamento). Disinfettare i topi strofinando con etanolo al 70% e ottenere il tessuto adiposo subito dopo …

Representative Results

Negli ultimi anni, l’aumento della prevalenza di obesità e T2D ha stimolato un’intensa ricerca dei meccanismi che mediano l’insulino-resistenza nel tessuto adiposo. Con il protocollo qui descritto, le APC possono essere differenziate in adipociti maturi per valutare la resistenza e la sensibilità all’insulina. Una volta che le APC raggiungono la confluenza, ci vogliono 10 giorni per completare la loro differenziazione in adipociti maturi e la loro induzione di insulino-resistenza mediata da TNF-α (<strong class="xfig"…

Discussion

Questo articolo fornisce un metodo per studiare la resistenza all’insulina che utilizza adipociti primari in coltura trattata con TNF-α. Questo modello ha il vantaggio che gli adipociti primari possono essere coltivati in condizioni definite per lunghi periodi di tempo con uno stretto controllo dei fattori ambientali cellulari²⁶. La durata del test è di 15-20 giorni, anche se possono verificarsi variazioni nella percentuale di adipociti differenziati tra gli esperimenti. Gli adipociti primari ha…

Materials

1. Isolation mouse adipocyte precursor cells
ACK lysing buffer	LONZA	10-548E
Anti-Biotin Microbeads	Miltenyi	130-090-485
Anti-CD31	eBioscience	13-0311-85
AutoMACS Pro Separator	Miltenyi
Basement membrane matrix (matrigel)	Corning	354234
bFGF	Sigma	F0291	Growth factor
BSA	Equitech-Bio, Inc.	BAC63-1000
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) – Biotin	eBioscience	13-0451-85
Collagenase, Type 1	Worthington Biochem	LS004197
Dexamethasone	Sigma	D1756
DMEM	GIBCO	12800017
DMEM low glucose	GIBCO	31600-034
EGF	Peprotech	315-09	Growth factor
FBS	GIBCO	26140-079
ITS mix	Sigma	I3146
L-ascorbic acid 2-phosphate	Sigma	A8960
LIF	Millipore	ESG1107	Growth factor
Linoleic acid-albumin	Sigma	L9530
MCDB 201 medium	Sigma	M6770
Normocin	InvivoGen	ant-nr-2
PDGF-BB	Peprotech	315-18	Growth factor
Peniciline-Streptomycine	BioWest	L0022-100
Pre-Separation Filters (70 µm)	Miltenyi	130-095-823
Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32	BD Pharmingen	553142
Trypsin-EDTA	GIBCO	25300062
2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction
3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX]	Sigma	I5879	Differentiation cocktail
BMP4	R&D Systems	5020-BP-010	Differentiation cocktail
Dexamethasone	Sigma	D1756	Differentiation cocktail
Insulin	Sigma	I9278
Rosiglitazone	Cayman	71742	Differentiation cocktail
TNFα	R&D Systems	210-TA-005
3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot
Anti-beta tubulin antibody	Abcam	ab6046
Bromophenol blue	BioRad	161-0404	Laemmli buffer
EDTA	Sigma	E5134	RIPA buffer
EGTA	Sigma	E4378	RIPA buffer
FluorChem E system	ProteinSimple
Glycerol	Sigma	G6279	Laemmli buffer
Glycine	Sigma	G7126	Running and Transfer buffer
Igepal	Sigma	I3021	RIPA buffer
2- mercaptoethanol	Sigma	M3148	Laemmli buffer
Methanol	JT Baker	907007	Transfer buffer
NaCl	JT Baker	3624-05	TBS-T
NaF	Sigma	77F-0379	RIPA buffer
NaOH	JT Baker	3722-19
Na4P2O7	Sigma	114F-0762	RIPA buffer
Na3VO4	Sigma	S6508	RIPA buffer
Nitrocellulose membrane	BioRad	1620112
Nonfat dry milk	BioRad	1706404	Blocking solution
Prestained protein standard	BioRad	1610395
Protease inhibitor cocktail	Sigma	P8340-5ML
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-035-132
Phospho- Insulin Receptor β	Cell signaling	3024
Phospho-Akt (Ser473) Antibody	Cell signaling	9271
Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody	Millipore	9432
Saccharose	JT Baker	407205	RIPA buffer
SDS	BioRad	1610302	Running and laemmli buffer
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34577
Tris-base	Promega	H5135	Running, transfer and laemmli buffer
Tris-HCl	JT Baker	4103-02	RIPA buffer – TBS
Tween 20	Sigma	P1379	TBS-T