1차 배양에서 분화된 마우스 지방세포: 인슐린 저항성 모델
Summary
이 프로토콜은 피하 지방에서 마우스 지방전구세포의 분리, 성숙한 지방세포로의 분화 및 인슐린 저항성 유도를 설명합니다. 인슐린 작용은 웨스턴 블롯을 통한 인슐린 신호 전달 경로 구성원의 인산화/활성화에 의해 평가됩니다. 이 방법을 사용하면 원발성 지방세포에서 인슐린 저항성/민감도를 직접 측정할 수 있습니다.
Abstract
인슐린 저항성은 표적 세포에 대한 인슐린의 감소된 효과로, 일반적으로 인슐린 수용체 신호 전달 감소에서 파생됩니다. 인슐린 저항성은 전 세계적으로 유병률이 높은 제2형 당뇨병(T2D) 및 기타 비만 유래 질병의 발병에 기여합니다. 따라서 인슐린 저항성의 기본 메커니즘을 이해하는 것은 매우 중요합니다. 생체 내 및 시험관 내에서 인슐린 저항성을 연구하기 위해 여러 모델이 사용되었습니다. 일차 지방 세포는 인슐린 저항성의 메커니즘을 연구하고 이 상태에 대항하는 분자와 인슐린 감작 약물의 분자 표적을 식별하는 매력적인 옵션을 나타냅니다. 여기에서 우리는 종양 괴사 인자-α(TNF-α)로 처리된 배양에서 일차 지방 세포를 사용하여 인슐린 저항성 모델을 확립했습니다.
자성 세포 분리 기술에 의해 콜라게나제로 분해된 마우스 피하 지방 조직에서 분리된 지방 세포 전구 세포(APC)는 1차 지방 세포로 분화됩니다. 인슐린 저항성은 인슐린 신호 전달 캐스케이드 구성원의 티로신 인산화/활성화를 감소시키는 전염증성 사이토카인인 TNF-α로 처리하여 유도됩니다. 인슐린 수용체 (IR), 인슐린 수용체 기질 (IRS-1) 및 단백질 키나아제 B (AKT)의 감소된 인산화는 웨스턴 블롯에 의해 정량화된다. 이 방법은 지방 조직에서 인슐린 저항성을 매개하는 메커니즘을 연구하는 훌륭한 도구를 제공합니다.
Introduction
인슐린은 췌장 섬 β 세포에서 생성되는 단백 동화 호르몬이며 포도당과 지질 대사의 핵심 조절자입니다. 인슐린은 많은 기능 중에서 포도당 흡수, 글리코겐 합성, 포도당 생성, 단백질 합성, 지방 생성 및 지방 분해를 조절합니다1. 인슐린과 인슐린의 수용체(IR) 상호작용 후의 초기 분자 신호는IR2의 내인성 티로신 단백질 키나아제 활성의 활성화이며, 그 결과 자가인산화3 및 인슐린 수용체 기질(insulin receptor substrates, IRS)로 알려진 단백질 계열의 활성화가 일어나며, 이는 어댑터 단백질에 결합하여 단백질 키나아제4의 캐스케이드를 활성화시킨다 . 인슐린은 포스파티딜이노시톨 3-키나아제(PI3K)-단백질 키나아제 B(AKT)와 라스-미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK)의 두 가지 주요 신호 전달 경로를 활성화합니다. 전자는 연료 항상성의 조절을 포함하여 다양한 생리적 기능에 관여하는 수많은 다운스트림 이펙터의 활성화를 위한 주요 분기점 또는 노드(4,5)를 구성하는 반면, 후자는 세포 성장 및 분화를 조절합니다(4,6). 인슐린 작용은 궁극적으로 세포 유형과 생리학적 맥락에 따라 달라진다7.
주요 인슐린 반응성 대사 조직 중 하나는 지방 조직입니다. 백색 지방 조직은 인간과 설치류에서 가장 풍부한 지방 유형으로, 피하 지방 (피부와 근육 사이)과 내장 지방 (복강 내 장기 주변)에 분포합니다. 부피가 크면 지방 세포 또는 지방 세포는 지방 조직에서 가장 풍부한 세포 유형입니다. 이 지방 세포는 갈색/베이지색(열성), 분홍색(유선) 및 흰색 8,9일 수 있습니다. 백색 지방 세포는 인슐린 의존 과정 인 트리글리세리드의 형태로 신체의 주요 에너지 매장량을 유지합니다. 인슐린은 포도당 수송과 지방 생성을 촉진하는 반면, 지방 분해 또는 지질 분해를 억제한다 7,10. 또한 지방전구세포가 지방세포(성숙한 지방을 저장하는 세포)로 분화하는 것을 촉진한다11.
인슐린 저항성은 정상적인 인슐린 수치가 약독화된 생물학적 반응을 일으켜 보상성 고인슐린혈증을 유발할 때 발생한다12. 인슐린 저항성은 과체중 및 비만과 관련된 질환으로5, 인슐린 저항성이 복합적으로 발생하면 제2형 당뇨병(T2D) 및 기타 대사 질환을 유발한다13. 고인슐린혈증은 말초 조직의 인슐린 저항성을 보상하여 정상적인 혈당 수치를 유지한다14. 그러나 인슐린 저항성 악화와 함께 궁극적인 β세포 손실 또는 고갈은 T2D와 일치하는 혈당 수치 상승으로 이어집니다5. 따라서 인슐린 저항성과 고인슐린혈증은 비만 유래 대사 질환의 발병에 기여할 수 있다15. 또한, 비만은 지방 조직에서 인슐린 저항성을 촉진하는 만성 저등급 국소 염증을 유발할 수 있다15,16,17. 또한, 섬유증, 염증, 혈관신생 및 지방생성 감소와 같은 지방 조직의 비만 유래 변화는 아디포넥틴 혈청 수치(인슐린 감작제)를 낮추고 플라스미노겐 활성제 억제제 1(PAI-1), 유리 지방산 및 엑소좀과 같은 인자의 혈류로의 분비를 증가시켜 인슐린 저항성을 악화시킵니다17.
인슐린 저항성의 기저에 있는 많은 측면은 아직 알려지지 않았습니다. 시험관 내 및 생체 내 모델은 지방 조직을 포함한 주요 표적 조직에서 인슐린 저항성을 매개하는 메커니즘을 연구하기 위해 개발되었습니다. 시험관 내 모델의 장점은 연구자가 환경 조건을 더 잘 제어할 수 있고 특정 세포 유형에서 인슐린 저항성을 평가할 수 있다는 것입니다. 특히, 지방세포 전구체 세포(APC)는 기증자 조직의 개별 표현형을 가지고 있으며, 이는 지방세포 세포주보다 생리학을 더 잘 반영할 수 있습니다. 시험관 내에서 인슐린 저항성을 유도하는 주요 인자는 종양 괴사 인자-α(TNF-α)입니다. TNF-α는 지방 조직18에서 지방세포와 대식세포에 의해 분비되는 전염증성 사이토카인이다. 적절한 지방조직 리모델링 및 확장에 필요하지만19, TNF-α에 장기간 노출되면 생체 내 지방 조직과 시험관 내 지방 세포에서 인슐린 저항성이 유발된다 20. 여러 세포 유형의 만성 TNF-α 처리는 IR 및 IRS-1 모두의 세린 인산화를 증가시켜 티로신 인산화 감소를 촉진한다21. 세린 잔기 상의 IRS-1의 증가된 인산화는 IR 티로신 키나아제 활성을 억제하며, 만성 TNF-α 치료가 인슐린 작용을 손상시키는 주요 기전 중 하나일 수 있다22,23. TNF-α는 핵 인자 ĸB 키나제 β(IKKβ) 및 c-Jun N 말단 키나아제(JNK)의 세린/트레오닌 키나제 억제제와 관련된 경로를 활성화합니다.24. JNK는 복잡한 전염증성 전사 프로그램을 유도할 뿐만 아니라 IRS-1을 직접 인산화하기도합니다 6.
인슐린 저항성의 병인을 이해하는 것은 T2D에 대한 미래 치료법의 개발을 안내하는 데 점점 더 중요해지고 있습니다. APC는 인슐린에 대한 민감성과 저항성을 포함한 지방 세포 생물학 연구와 전신 환경과 무관한 지방 세포의 고유 특성을 식별하는 데 탁월한 모델임이 입증되었습니다. APC는 다른 지방 저장소에서 쉽게 얻을 수 있으며 적절한 조건에서 성숙한 지방 세포로 분화됩니다. 이 방법을 사용하면 지방 세포에서 인슐린 저항성/민감도에 대한 직접적인 영향을 평가할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 논문은 TNF-α로 처리된 배양물에서 일차 지방세포를 이용하는 인슐린 저항성을 연구하는 방법을 제공한다. 이 모델은 세포 환경 인자의 엄격한 제어와 함께 일차 지방 세포가 장기간 동안 정의된 조건 하에서 배양될 수 있다는 장점이 있다26. 분석 기간은 15-20 일이지만 분화 된 지방 세포의 비율에 변화가 실험 사이에 발생할 수 있습니다. 일차 지방세포는 배양에서 지속적으?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
기술 지원을 아끼지 않은 다니엘 몬드라곤, 안토니오 프라도, 페르난도 로페스-바레라, 마르틴 가르시아-세르빈, 알레한드라 카스티야, 마리아 안토니에타 카르바호, 그리고 원고를 비판적으로 편집해 준 제시카 곤잘레스 노리스에게 감사드립니다. 이 프로토콜은 Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (YM에게)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| 1. Isolation mouse adipocyte precursor cells | |||
| ACK lysing buffer | LONZA | 10-548E | |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi | 130-090-485 | |
| Anti-CD31 | eBioscience | 13-0311-85 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | ||
| Basement membrane matrix (matrigel) | Corning | 354234 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | Growth factor |
| BSA | Equitech-Bio, Inc. | BAC63-1000 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) – Biotin | eBioscience | 13-0451-85 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochem | LS004197 | |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | |
| DMEM | GIBCO | 12800017 | |
| DMEM low glucose | GIBCO | 31600-034 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Growth factor |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| ITS mix | Sigma | I3146 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Growth factor |
| Linoleic acid-albumin | Sigma | L9530 | |
| MCDB 201 medium | Sigma | M6770 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| PDGF-BB | Peprotech | 315-18 | Growth factor |
| Peniciline-Streptomycine | BioWest | L0022-100 | |
| Pre-Separation Filters (70 µm) | Miltenyi | 130-095-823 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO | 25300062 | |
| 2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction | |||
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX] | Sigma | I5879 | Differentiation cocktail |
| BMP4 | R&D Systems | 5020-BP-010 | Differentiation cocktail |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Differentiation cocktail |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Rosiglitazone | Cayman | 71742 | Differentiation cocktail |
| TNFα | R&D Systems | 210-TA-005 | |
| 3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot | |||
| Anti-beta tubulin antibody | Abcam | ab6046 | |
| Bromophenol blue | BioRad | 161-0404 | Laemmli buffer |
| EDTA | Sigma | E5134 | RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E4378 | RIPA buffer |
| FluorChem E system | ProteinSimple | ||
| Glycerol | Sigma | G6279 | Laemmli buffer |
| Glycine | Sigma | G7126 | Running and Transfer buffer |
| Igepal | Sigma | I3021 | RIPA buffer |
| 2- mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Laemmli buffer |
| Methanol | JT Baker | 907007 | Transfer buffer |
| NaCl | JT Baker | 3624-05 | TBS-T |
| NaF | Sigma | 77F-0379 | RIPA buffer |
| NaOH | JT Baker | 3722-19 | |
| Na4P2O7 | Sigma | 114F-0762 | RIPA buffer |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | RIPA buffer |
| Nitrocellulose membrane | BioRad | 1620112 | |
| Nonfat dry milk | BioRad | 1706404 | Blocking solution |
| Prestained protein standard | BioRad | 1610395 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-5ML | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-132 | |
| Phospho- Insulin Receptor β | Cell signaling | 3024 | |
| Phospho-Akt (Ser473) Antibody | Cell signaling | 9271 | |
| Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody | Millipore | 9432 | |
| Saccharose | JT Baker | 407205 | RIPA buffer |
| SDS | BioRad | 1610302 | Running and laemmli buffer |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| Tris-base | Promega | H5135 | Running, transfer and laemmli buffer |
| Tris-HCl | JT Baker | 4103-02 | RIPA buffer – TBS |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | TBS-T |
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