Adipocitos diferenciados de ratón en cultivo primario: un modelo de resistencia a la insulina
Summary
Este protocolo describe el aislamiento de preadipocitos de ratón de la grasa subcutánea, su diferenciación en adipocitos maduros y la inducción de resistencia a la insulina. La acción de la insulina se evalúa mediante la fosforilación/activación de los miembros de la vía de señalización de la insulina a través del western blot. Este método permite la determinación directa de la resistencia/sensibilidad a la insulina en adipocitos primarios.
Abstract
La resistencia a la insulina es un efecto reducido de la insulina en sus células diana, generalmente derivado de la disminución de la señalización del receptor de insulina. La resistencia a la insulina contribuye al desarrollo de diabetes tipo 2 (DT2) y otras enfermedades derivadas de la obesidad de alta prevalencia en todo el mundo. Por lo tanto, comprender los mecanismos subyacentes a la resistencia a la insulina es de gran relevancia. Se han utilizado varios modelos para estudiar la resistencia a la insulina tanto in vivo como in vitro; Los adipocitos primarios representan una opción atractiva para estudiar los mecanismos de resistencia a la insulina e identificar moléculas que contrarresten esta condición y las dianas moleculares de los fármacos sensibilizantes a la insulina. Aquí, hemos establecido un modelo de resistencia a la insulina utilizando adipocitos primarios en cultivo tratados con factor de necrosis tumoral α (TNF-α).
Las células precursoras de adipocitos (APC), aisladas del tejido adiposo subcutáneo de ratón digerido por colagenasa mediante tecnología de separación celular magnética, se diferencian en adipocitos primarios. La resistencia a la insulina es inducida por el tratamiento con TNF-α, una citoquina proinflamatoria que reduce la fosforilación / activación de la tirosina de los miembros de la cascada de señalización de insulina. La disminución de la fosforilación del receptor de insulina (IR), el sustrato del receptor de insulina (IRS-1) y la proteína quinasa B (AKT) se cuantifican mediante Western blot. Este método proporciona una excelente herramienta para estudiar los mecanismos que median la resistencia a la insulina en el tejido adiposo.
Introduction
La insulina es una hormona anabólica producida por las células β de los islotes pancreáticos y el regulador clave del metabolismo de la glucosa y los lípidos. Entre sus múltiples funciones, la insulina regula la captación de glucosa, la síntesis de glucógeno, la gluconeogénesis, la síntesis de proteínas, la lipogénesis y la lipólisis1. La señal molecular inicial después de la interacción de la insulina con su receptor (IR) es la activación de la actividad intrínseca de la proteína tirosina quinasa de IR2, lo que resulta en su autofosforilación3 y la posterior activación de una familia de proteínas conocidas como sustratos receptores de insulina (IRS), que se une a proteínas adaptadoras que conducen a la activación de una cascada de proteínas quinasas4 . La insulina activa dos vías principales de señalización: fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K)-proteína quinasa B (AKT) y proteína quinasa activada por mitógenos Ras (MAPK). El primero constituye un importante punto de ramificación o nodo 4,5 para la activación de numerosos efectores aguas abajo implicados en diversas funciones fisiológicas, incluida la regulación de la homeostasis del combustible, mientras que el segundo regula el crecimiento y la diferenciación celular 4,6. Las acciones de la insulina dependen en última instancia del tipo de célula y del contexto fisiológico7.
Uno de los principales tejidos metabólicos sensibles a la insulina es el tejido adiposo. El tejido adiposo blanco es el tipo de grasa más abundante en humanos y roedores, distribuida dentro de la grasa subcutánea (entre la piel y los músculos) y la grasa visceral (alrededor de los órganos de la cavidad abdominal). Dado su gran volumen, los adipocitos o células grasas son el tipo de célula más abundante en el tejido adiposo. Estas células grasas pueden ser marrones/beige (termogénicas), rosadas (en la glándula mamaria) y blancas 8,9. Los adipocitos blancos mantienen las principales reservas de energía en el cuerpo en forma de triglicéridos, un proceso dependiente de la insulina. La insulina promueve el transporte de glucosa y la lipogénesis, mientras que inhibe la lipólisis o la descomposición lipídica 7,10. También facilita la diferenciación de los preadipocitos en adipocitos, las células maduras que almacenan grasa11.
La resistencia a la insulina ocurre cuando un nivel normal de insulina produce una respuesta biológica atenuada, resultando en hiperinsulinemia compensatoria12. La resistencia a la insulina es una condición asociada al sobrepeso y la obesidad5, que cuando se combina conduce a la diabetes tipo 2 (DT2) y otras enfermedades metabólicas13. La hiperinsulinemia compensa la resistencia a la insulina en los tejidos periféricos para mantener niveles normales de glucosa en sangre14. Sin embargo, la eventual pérdida o agotamiento de β células, junto con la resistencia exacerbada a la insulina, conduce a niveles elevados de glucosa en sangre consistentes con DT25. Por lo tanto, la resistencia a la insulina y la hiperinsulinemia pueden contribuir para el desarrollo de enfermedades metabólicas derivadas de la obesidad15. Además, la obesidad puede causar inflamación local crónica de bajo grado que promueve la resistencia a la insulina en el tejido adiposo15,16,17. Además, las alteraciones derivadas de la obesidad en el tejido adiposo, como la fibrosis, la inflamación y la reducción de la angiogénesis y la adipogénesis, conducen a niveles séricos más bajos de adiponectina (un sensibilizador a la insulina) y al aumento de la secreción de factores como el inhibidor del activador del plasminógeno 1 (PAI-1), ácidos grasos libres y exosomas en el torrente sanguíneo, exacerbando la resistencia a la insulina17.
Muchos aspectos subyacentes a la resistencia a la insulina siguen siendo desconocidos. Se han desarrollado modelos in vitro e in vivo para estudiar los mecanismos que median la resistencia a la insulina en los principales tejidos diana, incluido el tejido adiposo. La ventaja de los modelos in vitro es que los investigadores tienen más control de las condiciones ambientales y pueden evaluar la resistencia a la insulina en tipos específicos de células. En particular, las células precursoras de adipocitos (APC) tienen el fenotipo individual del tejido del donante, que podría reflejar la fisiología mejor que las líneas celulares de adipocitos. Un factor principal que induce la resistencia a la insulina in vitro es el factor de necrosis tumoral α (TNF-α). El TNF-α es una citocina proinflamatoria secretada por adipocitos y macrófagos en el tejido adiposo18. Si bien es necesario para la correcta remodelación y expansión del tejido adiposo19, la exposición a largo plazo al TNF-α induce resistencia a la insulina en el tejido adiposo in vivo y en los adipocitos in vitro20. El tratamiento crónico con TNF-α de varios tipos de células conduce a un aumento de la fosforilación de serina tanto de IR como de IRS-1, promoviendo así la disminución de la fosforilación de tirosina21. El aumento de la fosforilación de IRS-1 en los residuos de serina inhibe la actividad de la tirosina quinasa IR y puede ser uno de los mecanismos clave por los cuales el tratamiento crónico con TNF-α perjudica la acción de la insulina22,23. El TNF-α activa vías que involucran el inhibidor de la serina/treonina quinasa del factor nuclear ĸB quinasa β (IKKβ) y la quinasa terminal c-Jun N (JNK)24. JNK induce un complejo programa transcripcional proinflamatorio, pero también fosforila directamente IRS-16.
Comprender la patogénesis de la resistencia a la insulina se ha vuelto cada vez más importante para guiar el desarrollo de futuras terapias contra la DT2. Las APC han demostrado ser un excelente modelo para el estudio de la biología de las células grasas, incluida la sensibilidad y la resistencia a la insulina, y para identificar las propiedades intrínsecas de los adipocitos independientemente del entorno sistémico. Las APC pueden obtenerse fácilmente de diferentes depósitos adiposos y, en las condiciones adecuadas, diferenciarse en adipocitos maduros. Con este método, se pueden evaluar los efectos directos sobre la resistencia/sensibilidad a la insulina en los adipocitos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo proporciona un método para estudiar la resistencia a la insulina que utiliza adipocitos primarios en cultivo tratado con TNF-α. Este modelo tiene la ventaja de que los adipocitos primarios pueden ser cultivados bajo condiciones definidas durante largos períodos de tiempo con un estricto control de los factores ambientales celulares26. La duración del ensayo es de 15-20 días, aunque pueden ocurrir variaciones en el porcentaje de adipocitos diferenciados entre experimentos. Los a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla y María Antonieta Carbajo por su asistencia técnica, y a Jessica González Norris por editar críticamente el manuscrito. Este protocolo fue apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (a Y.M.).
Materials
| 1. Isolation mouse adipocyte precursor cells | |||
| ACK lysing buffer | LONZA | 10-548E | |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi | 130-090-485 | |
| Anti-CD31 | eBioscience | 13-0311-85 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | ||
| Basement membrane matrix (matrigel) | Corning | 354234 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | Growth factor |
| BSA | Equitech-Bio, Inc. | BAC63-1000 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) – Biotin | eBioscience | 13-0451-85 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochem | LS004197 | |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | |
| DMEM | GIBCO | 12800017 | |
| DMEM low glucose | GIBCO | 31600-034 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Growth factor |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| ITS mix | Sigma | I3146 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Growth factor |
| Linoleic acid-albumin | Sigma | L9530 | |
| MCDB 201 medium | Sigma | M6770 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| PDGF-BB | Peprotech | 315-18 | Growth factor |
| Peniciline-Streptomycine | BioWest | L0022-100 | |
| Pre-Separation Filters (70 µm) | Miltenyi | 130-095-823 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO | 25300062 | |
| 2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction | |||
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX] | Sigma | I5879 | Differentiation cocktail |
| BMP4 | R&D Systems | 5020-BP-010 | Differentiation cocktail |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Differentiation cocktail |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Rosiglitazone | Cayman | 71742 | Differentiation cocktail |
| TNFα | R&D Systems | 210-TA-005 | |
| 3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot | |||
| Anti-beta tubulin antibody | Abcam | ab6046 | |
| Bromophenol blue | BioRad | 161-0404 | Laemmli buffer |
| EDTA | Sigma | E5134 | RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E4378 | RIPA buffer |
| FluorChem E system | ProteinSimple | ||
| Glycerol | Sigma | G6279 | Laemmli buffer |
| Glycine | Sigma | G7126 | Running and Transfer buffer |
| Igepal | Sigma | I3021 | RIPA buffer |
| 2- mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Laemmli buffer |
| Methanol | JT Baker | 907007 | Transfer buffer |
| NaCl | JT Baker | 3624-05 | TBS-T |
| NaF | Sigma | 77F-0379 | RIPA buffer |
| NaOH | JT Baker | 3722-19 | |
| Na4P2O7 | Sigma | 114F-0762 | RIPA buffer |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | RIPA buffer |
| Nitrocellulose membrane | BioRad | 1620112 | |
| Nonfat dry milk | BioRad | 1706404 | Blocking solution |
| Prestained protein standard | BioRad | 1610395 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-5ML | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-132 | |
| Phospho- Insulin Receptor β | Cell signaling | 3024 | |
| Phospho-Akt (Ser473) Antibody | Cell signaling | 9271 | |
| Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody | Millipore | 9432 | |
| Saccharose | JT Baker | 407205 | RIPA buffer |
| SDS | BioRad | 1610302 | Running and laemmli buffer |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| Tris-base | Promega | H5135 | Running, transfer and laemmli buffer |
| Tris-HCl | JT Baker | 4103-02 | RIPA buffer – TBS |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | TBS-T |
References
- Elmus, G. B. Insulin signaling and insulin resistance. Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).
- Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system. Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).
- Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. R. Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit of its own receptor. Science. 215 (4529), 185-187 (1982).
- Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 85-96 (2006).
- Insulin Resistance. StatPearls Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/ (2021)
- Petersen, M. C., Shulm, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
- Batista, T. M., Haider, N., Kahn, C. R. Defining the underlying defect in insulin action in type 2 diabetes. Diabetologia. 64 (5), 994-1006 (2021).
- Unamuno, X., Frühbeck, G., Catalán, V. Adipose Tissue. Encyclopedia of Endocrine Diseases. Second edition. , 370-384 (2019).
- Cinti, S. Pink adipocytes. Trends in Endocrinology & Metabolism. 29 (9), 651-666 (2018).
- Kahn, B. B., Flier, J. S. Obesity and insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 106 (4), 473-481 (2000).
- Klemm, D. J., et al. Insulin-induced adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 276 (30), 28430-28435 (2001).
- Wilcox, G. Insulin and insulin resistance. The Clinical Biochemist. Reviews. 26 (2), 19-39 (2005).
- Yohannes, T. W. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 13, 3611-3616 (2020).
- James, D. E., Stöckli, J., Birnbaum, M. J. The etiology and molecular landscape of insulin resistance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (11), 751-771 (2021).
- Wondmkun, Y. T. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrime and Obesity: Targets and Therapy. 9 (13), 3611-3616 (2020).
- Hardy, O. T., Czech, M. P., Corvera, S. What causes the insulin resistance underlying obesity. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 19 (2), 81-87 (2012).
- Klein, S., Gastaldelli, A., Yki-Järvinen, H., Scherer, P. E. Why does obesity cause diabetes. Cell Metabolism. 34 (1), 11-20 (2022).
- Lo, K., et al. Analysis of in vitro insulin-resistance models and their physiological relevance to in vivo diet-induced adipose insulin resistance. Cell Reports. 5 (1), 259-270 (2013).
- Asterholm, I. W., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Murray, D. L., Choy, L. N., Spiegelman, B. M. Tumor necrosis factor alpha inhibits signaling from the insulin receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (11), 4854-4858 (1994).
- Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Parijs, L. V., Lodish, H. F. Tumor necrosis factor-α suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes. Nuclear factor-κB activation by TNF-α is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 009191 (2014).
- Hotamisligil, G. S., et al. IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-alpha- and obesity-induced insulin resistance. Science. 271 (5249), 665-668 (1996).
- Copps, K. D., White, M. F. Regulation of insulin sensitivity by serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate proteins IRS1 and IRS2. Diabetologia. 55 (10), 2565-2582 (2012).
- Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).
- Skurk, T., Hauner, H. Primary culture of human adipocyte precursor cells: expansion and differentiation. Methods in Molecular Biology. 806, 215-226 (2012).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 456, 201-219 (2008).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Hausman, D. B., DiGirolamo, M., Bartness, T. J., Hausman, G. J., Martin, R. J. The biology of white adipocyte proliferation. Obesity Reviews. 2 (4), 239-254 (2001).
- Kirkland, I. M., Tchkonia, T., Pirtskhalava, T., Han, J., Karagiannides, I. Adipogenesis and aging: does aging make fat go MAD. Experimental Geronotology. 37 (6), 757-767 (2002).
- Guo, W., et al. Aging results in paradoxical susceptibility of fat cell progenitors to lipotoxicity. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (4), 1041-1051 (2007).
- Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Van Parijs, L., Lodish, H. F.Tumor necrosis factor-a suppresses adipocyte-specific genes and activatesexpression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNF-a is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
- Jager, J., Gre ́meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. Interleukin-1b-induced insulin resistance in adipocytes throughdown-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Rotter, V., Nagaev, I., Smith, U. Interleukin-6 (IL-6) induces insulinresistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor-a,overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects. The Journal of Biological Chemistry. 278 (46), 45777-45784 (2003).
- Isidor, M. S., et al. Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes. International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).
- Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
