Primer Kültürde Diferansiye Fare Adipositleri: İnsülin Direncinin Bir Modeli
Summary
Bu protokol, fare preadipositlerinin deri altı yağdan izolasyonunu, olgun adipositlere farklılaşmasını ve insülin direncinin indüklenmesini açıklar. İnsülin etkisi, batı lekesi boyunca insülin sinyal yolunun üyelerinin fosforilasyonu / aktivasyonu ile değerlendirilir. Bu yöntem, primer adipositlerde insülin direncinin/duyarlılığının doğrudan belirlenmesini sağlar.
Abstract
İnsülin direnci, insülinin hedef hücreleri üzerindeki azaltılmış bir etkisidir ve genellikle azalmış insülin reseptör sinyalizasyonundan kaynaklanır. İnsülin direnci, tip 2 diyabet (T2D) ve dünya çapında yüksek prevalansı olan diğer obezite kaynaklı hastalıkların gelişimine katkıda bulunur. Bu nedenle, insülin direncinin altında yatan mekanizmaları anlamak büyük önem taşımaktadır. İnsülin direncini hem in vivo hem de in vitro olarak incelemek için çeşitli modeller kullanılmıştır; Primer adipositler, insülin direncinin mekanizmalarını incelemek ve bu duruma ve insülin duyarlılaştırıcı ilaçların moleküler hedeflerine karşı koyan molekülleri tanımlamak için çekici bir seçenektir. Burada, tümör nekroz faktörü-α (TNF-α) ile tedavi edilen kültürde primer adipositleri kullanarak bir insülin direnci modeli oluşturduk.
Manyetik hücre ayırma teknolojisi ile kollajenaz ile sindirilmiş fare deri altı yağ dokusundan izole edilen adiposit öncü hücreleri (APC’ler), primer adipositlere ayrılır. İnsülin direnci daha sonra insülin sinyal kaskadı üyelerinin tirozin fosforilasyonunu / aktivasyonunu azaltan proinflamatuar bir sitokin olan TNF-α ile tedavi ile indüklenir. İnsülin reseptörünün (IR), insülin reseptör substratının (IRS-1) ve protein kinaz B’nin (AKT) azalmış fosforilasyonu, batı lekesi ile ölçülür. Bu yöntem, yağ dokusunda insülin direncine aracılık eden mekanizmaları incelemek için mükemmel bir araç sağlar.
Introduction
İnsülin, pankreas adacığı β hücreleri tarafından üretilen anabolik bir hormondur ve glikoz ve lipit metabolizmasının anahtar düzenleyicisidir. Birçok işlevi arasında, insülin glikoz alımını, glikojen sentezini, glukoneogenezi, protein sentezini, lipogenezi ve lipoliz1’i düzenler. Reseptörü (IR) ile insülin etkileşiminden sonraki ilk moleküler sinyal, IR2’nin intrinsik tirozin protein kinaz aktivitesinin aktivasyonudur, bu da otofosforilasyon3 ile sonuçlanır ve daha sonra adaptör proteinlerine bağlanan insülin reseptör substratları (IRS) olarak bilinen bir protein ailesinin aktivasyonudur. protein kinazları4 . İnsülin iki ana sinyal yolunu aktive eder: fosfatidilinositol 3-kinaz (PI3K)-protein kinaz B (AKT) ve Ras-mitojen ile aktive edilmiş protein kinaz (MAPK). Birincisi, yakıt homeostazının düzenlenmesi de dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik fonksiyonlarda yer alan çok sayıda aşağı akış efektörünün aktivasyonu için ana bir dal noktası veya düğüm 4,5 oluştururken, ikincisi hücre büyümesini ve farklılaşmasını düzenler 4,6. İnsülin eylemleri sonuçta hücre tipine ve fizyolojik bağlama bağlıdır7.
İnsüline duyarlı ana metabolik dokulardan biri yağ dokusudur. Beyaz yağ dokusu, insanlarda ve kemirgenlerde, deri altı yağ (cilt ve kaslar arasında) ve viseral yağ (karın boşluğundaki organların etrafında) içinde dağılmış en bol yağ türüdür. Büyük hacimleri göz önüne alındığında, adipositler veya yağ hücreleri yağ dokusunda en bol bulunan hücre tipidir. Bu yağ hücreleri kahverengi/bej (termojenik), pembe (meme bezinde) ve beyaz 8,9 olabilir. Beyaz adipositler vücuttaki ana enerji rezervlerini insüline bağımlı bir süreç olan trigliseritler şeklinde tutar. İnsülin glikoz taşınımını ve lipogenezi teşvik ederken, lipoliz veya lipit parçalanmasını inhibe eder 7,10. Aynı zamanda preadipositlerin adipositlere farklılaşmasını kolaylaştırır – olgun yağ depolayan hücreler11.
İnsülin direnci, normal bir insülin seviyesi zayıflatılmış bir biyolojik yanıt ürettiğinde ortaya çıkar ve telafi edici hiperinsülinemi12 ile sonuçlanır. İnsülin direnci, aşırı kilolu ve obezite5 ile ilişkili bir durumdur, kombine edildiğinde tip 2 diyabet (T2D) ve diğer metabolik hastalıklara yol açar13. Hiperinsülinemi, normal kan şekeri seviyelerini korumak için periferik dokulardaki insülin direncini telafi eder14. Bununla birlikte, nihai β hücre kaybı veya tükenmesi, şiddetlenmiş insülin direnci ile birlikte, T2D5 ile tutarlı yüksek kan şekeri seviyelerine yol açar. Bu nedenle, insülin direnci ve hiperinsülinemi obezite kaynaklı metabolik hastalıkların gelişimine katkıda bulunabilir15. Ayrıca, obezite yağ dokusunda insülin direncini artıran kronik düşük dereceli lokal inflamasyona neden olabilir15,16,17. Ek olarak, yağ dokusunda fibroz, inflamasyon ve azalmış anjiyogenez ve adipogenez gibi obezite kaynaklı değişiklikler, adiponektin serum seviyelerinin (bir insülin duyarlılaştırıcı) düşmesine ve plazminojen aktivatör inhibitörü 1 (PAI-1), serbest yağ asitleri ve eksozomlar gibi faktörlerin kan dolaşımına salgılanmasının artmasına neden olarak insülin direncini şiddetlendirir17.
İnsülin direncinin altında yatan birçok yön bilinmemektedir. İn vitro ve in vivo modeller, yağ dokusu da dahil olmak üzere ana hedef dokularda insülin direncine aracılık eden mekanizmaları incelemek için geliştirilmiştir. İn vitro modellerin avantajı, araştırmacıların çevresel koşullar üzerinde daha fazla kontrole sahip olmaları ve spesifik hücre tiplerinde insülin direncini değerlendirebilmeleridir. Özellikle, adiposit öncü hücreleri (APC’ler), fizyolojiyi adiposit hücre hatlarından daha iyi yansıtabilecek donör dokunun bireysel fenotipine sahiptir. İn vitro insülin direncini indükleyen ana faktör tümör nekroz faktörü-α’dir (TNF-α). TNF-α, adipoz doku18’de adipositler ve makrofajlar tarafından salgılanan proinflamatuar bir sitokindir. Uygun yağ dokusu yeniden şekillenmesi ve genişlemesi için gerekli olsa da19, TNF-α’ye uzun süreli maruz kalma, in vivo yağ dokusunda ve in vitro20 adipositlerde insülin direncini indükler. Çeşitli hücre tiplerinin kronik TNF-α tedavisi, hem IR hem de IRS-1’in serin fosforilasyonunun artmasına neden olur, böylece azalmış tirozin fosforilasyonunu teşvik eder21. IRS-1’in serin kalıntıları üzerindeki fosforilasyonunun artması, IR tirozin kinaz aktivitesini inhibe eder ve kronik TNF-α tedavisinin insülin etkisini bozduğu anahtar mekanizmalardan biri olabilir22,23. TNF-α, nükleer faktör ĸB kinaz β (IKKβ) ve c-Jun N terminal kinazın (JNK)24’ün serin/treonin kinaz inhibitörünü içeren yolları aktive eder. JNK, karmaşık bir proinflamatuar transkripsiyonel programı indükler, ancak aynı zamanda IRS-16’yı doğrudan fosforile eder.
İnsülin direncinin patogenezini anlamak, T2D’ye karşı gelecekteki tedavilerin geliştirilmesine rehberlik etmek için giderek daha önemli hale gelmiştir. APC’lerin, insüline duyarlılık ve direnç de dahil olmak üzere yağ hücresi biyolojisinin incelenmesi ve sistemik ortamdan bağımsız olarak adipositlerin içsel özelliklerinin tanımlanması için mükemmel bir model olduğu kanıtlanmıştır. APC’ler farklı yağ depolarından kolayca elde edilebilir ve uygun koşullar altında olgun adipositlere ayrılabilir. Bu yöntemle adipositlerde insülin direnci/duyarlılığı üzerine doğrudan etkiler değerlendirilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, TNF-α ile tedavi edilen kültürde primer adipositleri kullanan insülin direncini incelemek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu model, birincil adipositlerin, hücresel çevresel faktörlerin sıkı bir kontrolü ile tanımlanmış koşullar altında uzun süre kültürlenebilmesi avantajına sahiptir26. Tahlil süresi 15-20 gündür, ancak deneyler arasında farklılaşmış adipositlerin yüzdesinde değişiklikler meydana gelebilir. Primer adipositler, kültürde sürekli olarak …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla ve María Antonieta Carbajo’ya teknik yardımları için ve Jessica Gonzalez Norris’e makaleyi eleştirel bir şekilde düzenledikleri için teşekkür ederiz. Bu protokol Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (Y.M.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 1. Isolation mouse adipocyte precursor cells | |||
| ACK lysing buffer | LONZA | 10-548E | |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi | 130-090-485 | |
| Anti-CD31 | eBioscience | 13-0311-85 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | ||
| Basement membrane matrix (matrigel) | Corning | 354234 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | Growth factor |
| BSA | Equitech-Bio, Inc. | BAC63-1000 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) – Biotin | eBioscience | 13-0451-85 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochem | LS004197 | |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | |
| DMEM | GIBCO | 12800017 | |
| DMEM low glucose | GIBCO | 31600-034 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Growth factor |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| ITS mix | Sigma | I3146 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Growth factor |
| Linoleic acid-albumin | Sigma | L9530 | |
| MCDB 201 medium | Sigma | M6770 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| PDGF-BB | Peprotech | 315-18 | Growth factor |
| Peniciline-Streptomycine | BioWest | L0022-100 | |
| Pre-Separation Filters (70 µm) | Miltenyi | 130-095-823 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO | 25300062 | |
| 2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction | |||
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX] | Sigma | I5879 | Differentiation cocktail |
| BMP4 | R&D Systems | 5020-BP-010 | Differentiation cocktail |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Differentiation cocktail |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Rosiglitazone | Cayman | 71742 | Differentiation cocktail |
| TNFα | R&D Systems | 210-TA-005 | |
| 3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot | |||
| Anti-beta tubulin antibody | Abcam | ab6046 | |
| Bromophenol blue | BioRad | 161-0404 | Laemmli buffer |
| EDTA | Sigma | E5134 | RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E4378 | RIPA buffer |
| FluorChem E system | ProteinSimple | ||
| Glycerol | Sigma | G6279 | Laemmli buffer |
| Glycine | Sigma | G7126 | Running and Transfer buffer |
| Igepal | Sigma | I3021 | RIPA buffer |
| 2- mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Laemmli buffer |
| Methanol | JT Baker | 907007 | Transfer buffer |
| NaCl | JT Baker | 3624-05 | TBS-T |
| NaF | Sigma | 77F-0379 | RIPA buffer |
| NaOH | JT Baker | 3722-19 | |
| Na4P2O7 | Sigma | 114F-0762 | RIPA buffer |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | RIPA buffer |
| Nitrocellulose membrane | BioRad | 1620112 | |
| Nonfat dry milk | BioRad | 1706404 | Blocking solution |
| Prestained protein standard | BioRad | 1610395 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-5ML | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-132 | |
| Phospho- Insulin Receptor β | Cell signaling | 3024 | |
| Phospho-Akt (Ser473) Antibody | Cell signaling | 9271 | |
| Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody | Millipore | 9432 | |
| Saccharose | JT Baker | 407205 | RIPA buffer |
| SDS | BioRad | 1610302 | Running and laemmli buffer |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| Tris-base | Promega | H5135 | Running, transfer and laemmli buffer |
| Tris-HCl | JT Baker | 4103-02 | RIPA buffer – TBS |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | TBS-T |
References
- Elmus, G. B. Insulin signaling and insulin resistance. Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).
- Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system. Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).
- Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. R. Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit of its own receptor. Science. 215 (4529), 185-187 (1982).
- Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 85-96 (2006).
- Insulin Resistance. StatPearls Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/ (2021)
- Petersen, M. C., Shulm, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
- Batista, T. M., Haider, N., Kahn, C. R. Defining the underlying defect in insulin action in type 2 diabetes. Diabetologia. 64 (5), 994-1006 (2021).
- Unamuno, X., Frühbeck, G., Catalán, V. Adipose Tissue. Encyclopedia of Endocrine Diseases. Second edition. , 370-384 (2019).
- Cinti, S. Pink adipocytes. Trends in Endocrinology & Metabolism. 29 (9), 651-666 (2018).
- Kahn, B. B., Flier, J. S. Obesity and insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 106 (4), 473-481 (2000).
- Klemm, D. J., et al. Insulin-induced adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 276 (30), 28430-28435 (2001).
- Wilcox, G. Insulin and insulin resistance. The Clinical Biochemist. Reviews. 26 (2), 19-39 (2005).
- Yohannes, T. W. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 13, 3611-3616 (2020).
- James, D. E., Stöckli, J., Birnbaum, M. J. The etiology and molecular landscape of insulin resistance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (11), 751-771 (2021).
- Wondmkun, Y. T. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrime and Obesity: Targets and Therapy. 9 (13), 3611-3616 (2020).
- Hardy, O. T., Czech, M. P., Corvera, S. What causes the insulin resistance underlying obesity. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 19 (2), 81-87 (2012).
- Klein, S., Gastaldelli, A., Yki-Järvinen, H., Scherer, P. E. Why does obesity cause diabetes. Cell Metabolism. 34 (1), 11-20 (2022).
- Lo, K., et al. Analysis of in vitro insulin-resistance models and their physiological relevance to in vivo diet-induced adipose insulin resistance. Cell Reports. 5 (1), 259-270 (2013).
- Asterholm, I. W., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Murray, D. L., Choy, L. N., Spiegelman, B. M. Tumor necrosis factor alpha inhibits signaling from the insulin receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (11), 4854-4858 (1994).
- Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Parijs, L. V., Lodish, H. F. Tumor necrosis factor-α suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes. Nuclear factor-κB activation by TNF-α is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 009191 (2014).
- Hotamisligil, G. S., et al. IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-alpha- and obesity-induced insulin resistance. Science. 271 (5249), 665-668 (1996).
- Copps, K. D., White, M. F. Regulation of insulin sensitivity by serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate proteins IRS1 and IRS2. Diabetologia. 55 (10), 2565-2582 (2012).
- Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).
- Skurk, T., Hauner, H. Primary culture of human adipocyte precursor cells: expansion and differentiation. Methods in Molecular Biology. 806, 215-226 (2012).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 456, 201-219 (2008).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Hausman, D. B., DiGirolamo, M., Bartness, T. J., Hausman, G. J., Martin, R. J. The biology of white adipocyte proliferation. Obesity Reviews. 2 (4), 239-254 (2001).
- Kirkland, I. M., Tchkonia, T., Pirtskhalava, T., Han, J., Karagiannides, I. Adipogenesis and aging: does aging make fat go MAD. Experimental Geronotology. 37 (6), 757-767 (2002).
- Guo, W., et al. Aging results in paradoxical susceptibility of fat cell progenitors to lipotoxicity. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (4), 1041-1051 (2007).
- Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Van Parijs, L., Lodish, H. F.Tumor necrosis factor-a suppresses adipocyte-specific genes and activatesexpression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNF-a is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
- Jager, J., Gre ́meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. Interleukin-1b-induced insulin resistance in adipocytes throughdown-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Rotter, V., Nagaev, I., Smith, U. Interleukin-6 (IL-6) induces insulinresistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor-a,overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects. The Journal of Biological Chemistry. 278 (46), 45777-45784 (2003).
- Isidor, M. S., et al. Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes. International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).
- Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
