Tarmmikrober, herunder ekstracellulære bakterier og intracellulære patogener som Orsay-virus og microsporidia (svampe), er ofte forbundet med vilde Caenorhabditis nematoder. Denne artikel præsenterer en protokol til påvisning og kvantificering af mikrober, der koloniserer og / eller inficerer C. elegans nematoder, og til måling af patogenbelastning efter kontrollerede infektioner i laboratoriet.
Tarmene af vilde Caenorhabditis nematoder er beboet af en række mikroorganismer, herunder tarmmikrobiom bakterier og patogener, såsom microsporidia og vira. På grund af lighederne mellem Caenorhabditis elegans og pattedyrs tarmceller samt kraften i C. elegans-systemet er denne vært opstået som et modelsystem til at studere værtstarm-mikrobeinteraktioner in vivo. Selvom det er muligt at observere nogle aspekter af disse interaktioner med lysfeltmikroskopi, er det svært at klassificere mikrober nøjagtigt og karakterisere omfanget af kolonisering eller infektion uden mere præcise værktøjer. RNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH) kan bruges som et værktøj til at identificere og visualisere mikrober i nematoder fra naturen eller til eksperimentelt at karakterisere og kvantificere infektion i nematoder inficeret med mikrober i laboratoriet. FISH-sonder, der mærker det meget rigelige lille underenhed ribosomalt RNA, producerer et lyst signal til bakterier og mikrosporidiske celler. Sonder designet til at målrette mod konserverede regioner af ribosomalt RNA, der er fælles for mange arter, kan detektere en bred vifte af mikrober, mens målretning af divergerende regioner af det ribosomale RNA er nyttigt til smallere detektion. På samme måde kan sonder designes til at mærke viralt RNA. En protokol for RNA FISH-farvning med enten paraformaldehyd (PFA) eller acetonefiksering præsenteres. PFA-fiksering er ideel til nematoder forbundet med bakterier, mikrosporidi og vira, mens acetonefiksering er nødvendig for visualisering af microsporidasporer. Dyr blev først vasket og fastgjort i paraformaldehyd eller acetone. Efter fiksering blev FISH-sonder inkuberet med prøver for at muliggøre hybridisering af sonder til det ønskede mål. Dyrene blev igen vasket og derefter undersøgt på mikroskopglas eller ved hjælp af automatiserede tilgange. Samlet set muliggør denne FISH-protokol detektion, identifikation og kvantificering af de mikrober, der befinder sig i C. elegans tarm, herunder mikrober, for hvilke der ikke er genetiske værktøjer til rådighed.
Caenorhabditis elegans er opstået som et kraftfuldt modelsystem til at studere medfødt immunitet og værtsmikrobeinteraktioner i tarmepitelcellerne 1,2. På grund af at have en gennemsigtig krop og kun 20 tarmceller repræsenterer C. elegans et bekvemt system til overvågning af processerne for mikrobiel intestinal kolonisering og infektion i forbindelse med en intakt organisme. Nematode tarmceller deler flere morfologiske og funktionelle ligheder med pattedyrs tarmepitelceller, hvilket gør dem til en medgørlig in vivo-model til dissektion af processer, der styrer mikrobiomkolonisering og patogeninfektion 3,4,5,6.
Wild C. elegans lever af en række mikrober, der koloniserer og inficerer tarmen, og prøveudtagning af disse nematoder har resulteret i opdagelsen af vira, eukaryoter (svampe, oomycetes) og bakterier, der naturligt forbinder med denne vært 7,8,9,10. Orsay-virussen blev fundet inficerende tarmen og er i øjeblikket den eneste kendte naturlige virus af C. elegans9. Microsporidia er svamperelaterede obligatoriske intracellulære patogener, der er den mest almindeligt forekommende infektion i vildtfanget Caenorhabditis, hvor flere arter er blevet opdaget, der inficerer C. elegans og relaterede nematoder 8,11. Mange bakterier findes almindeligvis i tarmens lumen af vildtfangede C. elegans, og flere arter er blevet etableret som en naturlig model for C. elegans mikrobiom (CeMbio)6,12,13,14. Opdagelse og karakterisering af mikrober, der naturligt koloniserer og / eller inficerer C. elegans, er afgørende for at forstå de genetiske mekanismer, der styrer disse værtsmikrobeinteraktioner, samt visualisere nye mikrobielle processer, der kun forekommer i forbindelse med et intakt værtsdyr.
Efter prøveudtagning screenes vilde nematoder via differentialinterferenskontrast (DIC) mikroskopi for at lede efter fænotyper, der er tegn på infektion eller kolonisering. For eksempel kan ændringer i det stereotype granulerede udseende af tarmcellerne være forbundet med tilstedeværelsen af en intracellulær parasitinfektion8. Specifikt er tabet af tarmgranulatet og nedsat cytosolisk viskositet tegn på virusinfektion, mens omorganisering af tarmgranulat til ‘riller’ kan indikere infektion med microsporidia i slægten Nematocida 8,9. Fordi der er en bred vifte af mikrober til stede i vilde C. elegans prøver, kan det være svært at skelne mellem mikrober gennem DIC mikroskopi. Oplysninger om den rumlige fordeling af mikrober inden for værten kan også være vanskelige at opdage på grund af den lille størrelse af mange mikrober15. Derudover er det ikke altid muligt at dyrke bestemte mikrober af interesse in vitro, hvilket fører til vanskeligheder med påvisning og / eller kvantificering.
RNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH) giver en metode til fluorescerende mærkning af mikrober ved at anvende fluorescerende sonder, der binder til RNA’et i den lille ribosomale underenhed (SSU) i faste celler. Hvis analyse af morfologiske egenskaber antyder en bestemt klasse af mikrober, kan FISH-sonder, der er målrettet mod specifikke eller brede klasser af sådanne mikrober, anvendes. For eksempel betragtes EUB338 som en universel sonde til bakteriel SSU og bruges almindeligvis til at detektere en lang række bakterier16. Protokollen beskrevet her bruger enkeltstrengede DNA-sonder, der er slutmærket med en fluorophore og specielt designet til at være komplementære til målet SSU for mikroben af interesse, selvom der er tidligere designede sonder tilgængelige16. Den største fordel ved at målrette mod SSU af mikrober er den relativt store overflod af dette RNA, som typisk omfatter 80% -90% af alt RNA i cellen, hvilket fører til farvning med et meget højt signal-støj-forhold17. Sonder kan også designes til at målrette RNA til at detektere vira, som Orsay-virus 9,18, som ofte er til stede i meget høje kopier i inficerede celler, hvis virussen aktivt replikerer.
Afhængigt af resultaterne med kendte sonder kan det være nødvendigt at indhente yderligere sekvensinformation for at designe mere specifikke sonder til artsbekræftelse in situ. En fælles tilgang er at bruge universelle primere mod konserverede regioner i SSU (16S for bakterier og 18S for eukaryoter) for at forstærke (via PCR) regioner, der er mere divergerende8. Ved hjælp af denne sekvensinformation kan sonder med mere artsspecificitet designes. Disse FISH-sonder kan derefter muliggøre identifikation af mikrober på en kulturuafhængig måde8. Derudover kan RNA FISH give indsigt i unikke morfologiske koloniserings- og infektionsegenskaber, herunder filamentations- eller vævslokaliseringsmønstre19,20. Forskellige farvede FISH-sonder kan bruges samtidigt, hvilket giver mulighed for visuel skelnen mellem mikrober i vilde nematodeprøver samt observation af mikrobe-mikrobedynamik inde i en vært15,20. Desuden kan RNA FISH-farvning anvendes til værtspatogeninteraktionsundersøgelser, hvor infektion og kolonisering af en kendt art let kan kvantificeres manuelt eller gennem automatiserede tilgange til at give indsigt i patogenbelastning, for eksempel ved sammenligning af C. elegans-mutanter, der enten har øget eller nedsat resistens over for infektion21.
Wild C. elegans er naturligt forbundet med en række mikrober. Forskere kan bruge RNA FISH til at opdage og identificere disse mikrober samt få indsigt i deres lokalisering i sammenhæng med et helt dyr. Mikrober med ønskelige eller interessante fænotyper kan identificeres gennem denne metode og derefter isoleres til yderligere karakterisering og sekventering. Forekomsten af talrige bakterieisolater fra vilde C. elegans kan også kvantificeres via RNA FISH29. Ved at bruge protokollen beskrevet her er det også muligt at observere kendte mikroorganismer inde i deres værter og lære mere om deres interaktioner. Det er vigtigt, at Orsay-virus og microsporidia er obligatoriske parasitter og ikke kan dyrkes uafhængigt af værten, så FISH er standardvisualiseringsværktøjet. Kolonisering eller infektion kan også kvantificeres gennem RNA FISH ved hjælp af nematoder dyrket på plader podet med en ønsket dyrkningsbar bakterie af interesse. Ud over farvning af mikroorganismer i C. elegans tarm kan denne protokol bruges til andre nematodestammer som C. tropicalis eller Oscheius tipulae 19,23.
Den største fordel ved FISH-protokollen er, at den tilbyder en enkel, hurtig og robust metode til at plette mikrober forbundet med C. elegans. Billeder fremstillet af FISH-farvning har et højt signal-støj-forhold, hvilket opnås ved at bruge FISH-sonder, der er målrettet mod SSU’ens rigelige RNA i prøven. Fordi der typisk er 30x eller højere niveauer af rRNA end rDNA, skyldes det meste af signalet fra FISH-farvning med sonder, der er målrettet mod rRNA, rRNA snarere end rDNA30. Desuden gør RNA FISH det muligt at se infektion eller kolonisering inden for rammerne af hele dyret. Denne visualisering lettes ved at co-farvning af værtskerner med DAPI og / eller ved hjælp af fluorescerende markerede stammer af C. elegans for bedre at fremhæve lokaliseringen af infektion eller kolonisering i prøven. For eksempel blev mikrosporidian-specifik FISH brugt til at bestemme vævstropismen af Nematocida displodere ved hjælp af et panel af C. elegans stammer med GFP-ekspression i forskellige væv20. Derudover er denne protokol modtagelig for ændringer, der gør det muligt for forskere at bestemme de ideelle forhold, der passer til deres specifikke behov (f.eks. Justering af fikseringsperioden, forøgelse af hybridiseringstemperaturen).
Et kritisk skridt i FISH-protokollen er fastsættelse af prøverne. Inkubationsperioden efter tilsætning af fikseringsmidlet er nødvendig for at give agenten tid til at gennemtrænge prøven. Længere inkubationstider er ikke ideelle til prøver, der indeholder transgene fluorescerende proteiner på grund af proteinnedbrydning af PFA over tid. For prøver, der indeholder GFP, er det bydende nødvendigt at bestemme den optimale fikseringstid for at muliggøre permeabilisering, samtidig med at GFP-signalet opretholdes.
FISH kan bruges til at plette for bakterier, vira eller microsporidia i C. elegans. Den bedste type fikseringsmiddel, der anvendes til FISH, afhænger imidlertid af prøven og downstream-kravene. Denne protokol præsenterer en PFA-opløsning som det primære fikseringsmiddel til pletter af bakterier og vira. PFA er dog ikke tilstrækkelig til visualisering af mikrosporidiske sporer, da det ikke kan trænge igennem sporevæggen. Til visualisering af sporer bør acetone anvendes i stedet. Selvom PFA-fiksering er effektiv til FISH-mærkning af andre livsstadier af mikrosporidier, herunder sporoplasmer, meronter og sporonter. Andre store forskelle ses mellem acetonefiksering og PFA-fiksering; Acetone er mere praktisk, fordi prøver hurtigt kan opbevares i fryseren efter tilsætning uden behov for vask. Imidlertid dræber acetone hurtigt enhver eksisterende GFP i en transgen vært. PFA er det foretrukne fikseringsmiddel, hvis det er vigtigt at bevare nogle fysiologiske strukturer i værten, da acetonefikserede dyr ser ud til at være mere nedbrudte, hvilket gør identifikation af nogle væv vanskeligere. Fordi prøverne er faste, tillader denne FISH-protokol ikke levende billeddannelse af værtsmikrobeinteraktioner in vivo. Imidlertid kan et pulsjagt-infektionstidsforløb efterfulgt af FISH-farvning af prøver på forskellige tidspunkter give en mulighed for at se en vis dynamik i mikrobiel infektion 19,20,31.
Et andet kritisk trin i hele protokollen er grundig vask af prøverne før og efter hybridisering. Før hybridisering, når ormene opsamles i mikrofugerørene, kan overskydende bakterier eller andre mikrober fra NGM-pladerne bæres med ormprøven. Tre vaske med PBS-T er standard; flere vaske kan dog være nødvendige for tilstrækkeligt at eliminere eksterne mikroorganismer, især når der anvendes stærkt forurenede, vildtisolerede C. elegans. Når man ser de monterede prøver efter FISH, kan der være noget resterende FISH-sonde, der producerer store mængder signal i baggrunden af prøven. Vasketemperaturen og antallet af vaske er vigtige for at fjerne den overskydende og ikke-specifikt bundne sonde. For at reducere baggrundsfluorescensen er det muligt at udføre to eller tre vaske med 1 ml WB hvert 30. minut i stedet for en vask med 1 ml WB i en time. Forskellige FISH-sonder kan kræve forskellige vasketemperaturer. Typisk er vasketemperaturen 2 °C over hybridiseringstemperaturen, men dette kan øges, hvis der er for meget baggrundsfluorescens (høj støj).
FISH-protokollen anvender fluorescerende sonder designet til at målrette mod artsspecifikt mikrobielt RNA, men FISH-sonder kan designes til andre transkripter med høj kopi. Andre FISH-sonder kan have forskellige smeltetemperaturer, så inkubationstrin skal muligvis udføres ved en højere eller lavere temperatur end beskrevet. FISH-farvning kan identificere den rumlige fordeling af mikrobiel kolonisering eller infektion inden for værten, hvilket giver mulighed for karakterisering af værtsmikrobe og mikrobe-mikrobe-interaktioner. En begrænsning er, at kun få konventionelle fluorophorer kan anvendes samtidigt, hvilket reducerer antallet af forskellige mikroorganismer, der kan detekteres via FISH på samme tid. Dette begrænser dets anvendelse til komplekse mikrobiomundersøgelser i C. elegans. Imidlertid anvender flerfarvet rRNA-målrettet FISH sonder mærket med ikke-kanoniske fluorophorer, der kan øge antallet af forskellige mikrobielle gruppemærker15. En anden begrænsning er, at det er vanskeligt at skelne mellem nært beslægtede arter, især bakterier, der har SSU-sekvenser, der er meget ens. Den ekstreme sekvensdivergens mellem microsporidia-arter hjælper imidlertid med at lette deres differentiering med denne protokol (figur 3)32,33.
Samlet set beskriver denne FISH-protokol en teknik til at detektere mikroorganismer inden for C. elegans. Det giver forskere mulighed for at bruge et gennemsigtigt og genetisk medgørligt modelsystem til at opdage og kvantificere kolonisering og infektion inden for rammerne af et intakt dyr samt identificere unik mikrobiel adfærd eller morfologi inden for værten. En fortrykt version af dette manuskript blev offentliggjort under gennemgang34.
The authors have nothing to disclose.
Tak til Dr. Marie-Anne Félix for at give os vilde nematodestammer. Dette arbejde blev støttet af NSF under CAREER Grant 2143718 og California State University under en CSUPERB New Investigator Award til RJL, NIH under R01 AG052622 og R01 GM114139 til ART og af et American Heart Association Fellowship til VL.
10% SDS | Invitrogen | AM9822 | |
Acetone | Fisher Scientific | A-11-1 | |
Antifade mounting serum with DAPI (Vectashield) | Vectalab | NC9524612 | |
EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
FISH probes (see Table 1) | LGC Biosearch Technologies | FISH probes were commercially purchased via custom oligonucleotide synthesis | |
KCl | Fisher Scientific | P217 | |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P-286 | |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S375-500 | |
NaCl | Fisher Scientific | S-671 | |
NH4Cl | Fisher Scientific | A-661 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 50-980-487 | CAUTION: PFA is a carcinogen. Handle appropriately |
Thermal mixer | Eppendorf | 5384000020 | |
Tris base | Fisher Scientific | BP152 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP-151 | |
Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |