Fabricage en karakterisering van laag-voor-laag Janus Base Nano-Matrix om kraakbeenregeneratie te bevorderen
Summary
Dit protocol beschrijft de assemblage van een laag-voor-laag Janus base nano-matrix (JBNm) scaffold door janus base nanotubes (JBNts), matrilin-3 en Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1) sequentieel toe te voegen. De JBNm werd gefabriceerd en gekarakteriseerd; bovendien vertoonde het een uitstekende bioactiviteit, waardoor celfuncties zoals adhesie, proliferatie en differentiatie werden aangemoedigd.
Abstract
Verschillende biomateriaalsteigers zijn ontwikkeld om celhechting en proliferatie te begeleiden in de hoop specifieke functies voor in vitro en in vivo gebruik te bevorderen. De toevoeging van groeifactoren aan deze biomateriaalsteigers wordt over het algemeen gedaan om een optimale celkweekomgeving te bieden, celdifferentiatie en de daaropvolgende functies te bemiddelen. De groeifactoren in een conventionele biomateriaalsteiger zijn echter meestal ontworpen om vrij te komen bij implantatie, wat kan leiden tot onbedoelde bijwerkingen op het omliggende weefsel of de omliggende cellen. Hier heeft de op DNA geïnspireerde Janus base nano-matrix (JBNm) met succes een zeer gelokaliseerde micro-omgeving bereikt met een laag-voor-laag structuur voor zelfvoorzienende kraakbeenweefselconstructies. JBNms zijn zelf geassembleerd uit Janus base nanobuisjes (JBNts), matriline-3, en transformerende groeifactor beta-1 (TGF-β1) via bioaffiniteit. De JBNm werd geassembleerd in een TGF-β1:matrilin-3:JBNt-verhouding van 1:4:10, omdat dit de bepaalde verhouding was waarbij een goede montage in de laag-voor-laag structuur kon plaatsvinden. Eerst werd de TGF-β1-oplossing toegevoegd aan de matriline-3-oplossing. Vervolgens werd dit mengsel meerdere keren gepipetteerd om voldoende homogeniteit te garanderen voordat de JBNt-oplossing werd toegevoegd. Deze vormde de laag-voor-laag JBNm, na meerdere malen opnieuw pipetteren. Een verscheidenheid aan experimenten werd uitgevoerd om de laag-voor-laag JBNm-structuur te karakteriseren, JBNts alleen, matrilin-3 alleen en TGF-β1 alleen. De vorming van JBNm werd bestudeerd met UV-Vis absorptiespectra en de structuur van de JBNm werd waargenomen met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Omdat de innovatieve laag-voor-laag JBNm-steiger op moleculaire schaal wordt gevormd, kan de fluorescerende kleurstof-gelabelde JBNm worden waargenomen. De TGF-β1 is beperkt tot de binnenste laag van de injecteerbare JBNm, die de afgifte van groeifactoren naar omliggende gebieden kan voorkomen, gelokaliseerde chondrogenese kan bevorderen en een anti-hypertrofische micro-omgeving kan bevorderen.
Introduction
Steigers in tissue engineering spelen een vitale rol bij het bieden van structurele ondersteuning voor celaanhechting en daaropvolgende weefselontwikkeling1. Doorgaans zijn conventionele weefselconstructies zonder steigers afhankelijk van de celkweekomgeving en toegevoegde groeifactoren om celdifferentiatie te bemiddelen. Bovendien is deze toevoeging van bioactieve moleculen aan steigers vaak de voorkeursbenadering bij het begeleiden van celdifferentiatie en functie 2,3. Sommige steigers kunnen de biochemische micro-omgeving van inheemse weefsels onafhankelijk nabootsen, terwijl andere de celfuncties rechtstreeks kunnen beïnvloeden via groeifactoren. Onderzoekers komen echter vaak uitdagingen tegen bij het selecteren van steigers die de celhechting, groei en differentiatie positief kunnen beïnvloeden, terwijl ze optimale structurele ondersteuning en stabiliteit bieden gedurende een lange periode 4,5. De bioactieve moleculen zijn vaak losjes gebonden aan de steiger, wat leidt tot een snelle afgifte van deze eiwitten bij implantatie, wat resulteert in hun afgifte op ongewenste locaties. Dit culmineert in bijwerkingen op weefsels of cellen die niet opzettelijk zijn gericht 6,7.
Steigers zijn meestal gemaakt van polymere materialen. De Janus base nano-matrix (JBNm) is een biomimetisch steigerplatform gemaakt met een nieuwe laag-voor-laag methode voor zelfvoorzienend kraakbeenweefsel construct8. Deze nieuwe DNA-geïnspireerde nanobuisjes hebben de naam Janus base nanotubes (JBNts) gekregen, omdat ze de structuur en oppervlaktechemie van collageen in de extracellulaire matrix (ECM) goed nabootsen. Met de toevoeging van bioactieve moleculen, zoals matriline-3 en Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1), kan de JBNm een optimale micro-omgeving creëren die vervolgens de gewenste cel- en weefselfunctionaliteit kan stimuleren9.
JBNts zijn nieuwe nanobuisjes afgeleid van synthetische versies van de nucleobase adenine en thymine. De JBNts worden gevormd door zelfassemblage10; zes synthetische nucleobasen binden zich om een ring te vormen, en deze ringen ondergaan π-π stapelingsinteracties om een nanobuisje van 200-300 μm in lengte11 te creëren. Deze nanobuisjes zijn structureel vergelijkbaar met collageeneiwitten; door een aspect van de inheemse kraakbeenmicro-omgeving na te bootsen, is aangetoond dat JBNts een gunstige hechtingsplaats bieden voor chondrocyten en menselijke mesenchymale stamcellen (hMSCs)11,12,13,14. Omdat de nanobuisjes zelfassemblage ondergaan en geen enkele vorm van initiator nodig hebben (zoals UV-licht), vertonen ze een opwindend potentieel als een injecteerbare steiger voor moeilijk bereikbare defectgebieden15.
Matrilin-3 is een structureel extracellulair matrixeiwit dat voorkomt in kraakbeen. Dit eiwit speelt een belangrijke rol bij chondrogenese en een goede kraakbeenfunctie16,17. Onlangs is het opgenomen in biomateriaalsteigers, wat chondrogenese zonder hypertrofie bevordert 9,18,19. Door dit eiwit in het JBNm op te nemen, worden kraakbeencellen aangetrokken door een stellage die vergelijkbare componenten bevat als die van de oorspronkelijke micro-omgeving. Bovendien is aangetoond dat matriline-3 nodig is voor een goede TGF-β1-signalering binnen chondrocyten20. Groeifactoren functioneren als signaalmoleculen, die specifieke groei van een bepaalde cel of weefsel veroorzaken. Om een optimale kraakbeenregeneratie te bereiken, zijn matriline-3 en TGF-β1 dus essentiële componenten binnen de JBNm. De toevoeging van TGF-β1 aan de laag-voor-laag steiger kan de kraakbeenregeneratie in een weefselconstructie verder bevorderen. TGF-β1 is een groeifactor die wordt gebruikt om het genezingsproces van osteochondrale defecten aan te moedigen, chondrocyten en hMSC-proliferatie en differentiatiete stimuleren 21,22. TGF-β1 speelt dus een sleutelrol in de kraakbeenregeneratie JBNm (J/T/M JBNm)23 en stimuleert een goede groei, vooral wanneer deze gelokaliseerd is in de JBNm-lagen.
Zoals eerder vermeld, worden groeifactoren meestal aan de buitenkant van steigers geassembleerd zonder specifieke inbouwmethoden. Hier, met de nauwkeurig ontworpen nano-architectuur van de biomaterialen, werd de JBNm ontwikkeld voor specifieke targeting van beoogde cellen en weefsels. De JBNm bestaat uit TGF-β1 geplakt op JBNt oppervlakken in de binnenste laag en matrilin-3 geplakt op JBNt oppervlakken in de buitenste laag24,25. De opname van TGF-β1 in de binnenste laag van de laag-voor-laag structuur zorgt voor een sterk gelokaliseerde micro-omgeving langs de JBNm-vezels, waardoor een homeostatisch weefselconstruct ontstaat met een veel langzamere afgifte van het eiwit12. De injecteerbaarheid van de JBNm maakt het een ideaal kraakbeenweefselconstruct voor verschillende toekomstige biomateriaaltoepassingen26.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het doel van deze studie is om een biomimetisch steigerplatform te ontwikkelen, de JBNm, om de beperkingen van conventionele weefselconstructies te overwinnen die afhankelijk zijn van celkweekomgevingen om celdifferentiatie te bemiddelen. De JBNm is een laag-voor-laag structuur scaffold voor een zelfvoorzienend kraakbeenweefsel construct. Het innovatieve ontwerp is gebaseerd op nieuwe DNA-geïnspireerde nanomaterialen, de JBNts. De JBNm, samengesteld uit JBNts30, TGF-β1 en matrilin-3, wordt geass…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door NIH-subsidies 7R01AR072027 en 7R03AR069383, NSF Career Award 1905785, NSF 2025362 en de Universiteit van Connecticut. Dit werk wordt ook gedeeltelijk ondersteund door NIH-subsidie S10OD016435.
Materials
| 10 % Normal Goat Serum | Thermo Fisher | 50062Z | Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining. |
| 24-well plate | Corning | 07-200-740 | 24-well plate used for comparative cell culture. |
| 384-Well Black Untreated Plate | Thermo Fisher | 262260 | 384-well plate used for absorption measurements. |
| 8-well chambered coverglass | Thermo Fisher | 155409PK | 8-well coverglass used for comparative cell culture. |
| 96-well flat bottom | Corning | 07-200-91 | 96-well plate used for comparative cell culture. |
| 96-Well Plate non- treated | Thermo Fisher | 260895 | 96-well plate used for comparative cell culture and analysis. |
| Agarose Gel | Sigma-Aldrich | A9539 | Hydrogel used for cell culture. |
| Agarose Gel | Sigma Aldrich | A9539 | Hydrogel used as an environment for cell culture. |
| Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit | Thermo Fisher | A30006 (488) and A30007 (555) | Fluorescent dye used to label proteins. |
| Anti-Collagen X Antibody | Thermo Fisher | 41-9771-82 | Antibody used to stain collagen-X. |
| Bio-Rad PCR Machine | Bio-Rad | Equipment used to perform PCR on samples. | |
| C28/I2 Chondrocyte Cell Line | Cells used to analyze proliferative abilities of various samples. | ||
| Cell Counting Kit 8 | Milipore Sigma | 96992 | Cell proliferation assay. |
| Cell Profiler | Broad Institute | Software used to analyze cell images. | |
| Cryostat Microtome | Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy. | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions. |
| Disposable cuvettes | FISHER Scientific | 14-955-128 | Container used for spectrophotometry. |
| DMEM Cell Culture Medium | Thermo Fisher | 10566032 | Media used to support cellular growth. |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | A4766801 | Serum used in cell culture medium to support cell growth. |
| Fluoromount-G Mounting Medium | Thermo Fisher | 00-4958-02 | Solution used to mount slides for immunostaining. |
| Formaldehyde | Compound used to fix samples prior to microtoming. | ||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher | A16110 | Antibody used for protein staining. |
| Human Mesenchymal Stem Cells | LONZA | PT-2501 | Cells used to analyze differentiative abilities of various samples. |
| Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium | LONZA | PT-3003 | Cell medium used to promote chondrogenic differentiation. |
| ImageJ | National Institutes of Health | Image analysis software used in conjunction with microscopy. | |
| itaq Universal SYBR Green One-Step Kit | BioRad | 1725150 | Kit used for PCR. |
| Janus-base nanotubes (JBNts) | Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool. | ||
| LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope | Tecnai | Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample. | |
| MATLAB | MathWorks | Statistical software used for modeling and data analysis. | |
| Matrilin-3 | Fisher Scientific | 3017MN050 | Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes. |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | Equipment used to measure absorption values of a sample. | |
| Nikon A1R Spectral Confocal Microscope | Nikon | A1R HD25 | Confocal microscope used to analyze samples. |
| Number 1.5 Chamber Coverglass | Thermo Fisher | 152250 | Environment for sterile cell culture and imaging. |
| Optimal Cutting Temperature Compound Reagent | Compound used to embed cells prior to microtoming. | ||
| Paraformaldehyde | Thermo Scientific | AAJ19943K2 | Compound used to fix cells. |
| PDC-32G Plasma Cleaner | Harrick Plasma | Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy. | |
| penicillin-streptomycin | GIBCO | 15-140-148 | Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture. |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 10010023 | Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation. |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | F-Actin red fluorescent dye. |
| Rneasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction. |
| Sucrose Solution | Solution used to process samples prior to microtoming. | ||
| TGF beta-1 Human ELISA Kit | Invitrogen | BMS249-4 | Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample. |
| TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21C | Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation. |
| Triton-X | Invitrogen | HFH10 | Compound used to lyse cells not fixed during staining process. |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher | 15596026 | Reagent used to isolate RNA. |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | Equipment used to measure zeta-potential values of a sample. |
References
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. European Spine Journal. 17, 467-479 (2008).
- Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
- Almeida, H. V., et al. Anisotropic shape-memory alginate scaffolds functionalized with either type i or type ii collagen for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part A. 23 (1-2), 55-68 (2017).
- Vinatier, C., Guicheux, J. Cartilage tissue engineering: From biomaterials and stem cells to osteoarthritis treatments. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59 (3), 139-144 (2016).
- Filardo, G., Kon, E., Roffi, A., Di Martino, A., Marcacci, M. Scaffold-based repair for cartilage healing: a systematic review and technical note. Arthroscopy. 29 (1), 174-186 (2013).
- James, A. W., et al. A review of the clinical side effects of bone morphogenetic protein-2. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 22 (4), 284-297 (2016).
- Blaney Davidson, E. N., vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. TGF-beta and osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 597-604 (2007).
- Chen, Y., Yang, K. Intra-articular drug delivery systems for arthritis treatment. Rheumatology Current Research. 2, 106 (2012).
- Liu, Q., et al. Suppressing mesenchymal stem cell hypertrophy and endochondral ossification in 3D cartilage regeneration with nanofibrous poly(l-lactic acid) scaffold and matrilin-3. Acta Biomaterialia. 76, 29-38 (2018).
- Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
- Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell anchorage. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 108 (4), 984-991 (2020).
- Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen, Y. Fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion. Journal of Visualized Experiments. (159), e61317 (2020).
- Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
- Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
- Yu, H., Chen, Y. Advanced biomedical techniques for gene delivery. Recent Patents on Biomedical Engineering (Discontinued). 5 (1), 23-28 (2012).
- Muttigi, M. S., Han, I., Park, H. K., Park, H., Lee, S. H. Matrilin-3 role in cartilage development and osteoarthritis). International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 590 (2016).
- Pei, M., Luo, J., Chen, Q. Enhancing and maintaining chondrogenesis of synovial fibroblasts by cartilage extracellular matrix protein matrilins. Osteoarthritis Cartilage. 16 (9), 1110-1117 (2008).
- Bello, A. B., et al. Matrilin3/TGFbeta3 gelatin microparticles promote chondrogenesis, prevent hypertrophy, and induce paracrine release in MSC spheroid for disc regeneration. NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 50 (2021).
- Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
- Jayasuriya, C. T., et al. Matrilin-3 chondrodysplasia mutations cause attenuated chondrogenesis, premature hypertrophy and aberrant response to TGF-beta in chondroprogenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (8), 14555-14573 (2014).
- Poniatowski, L. A., Wojdasiewicz, P., Gasik, R., Szukiewicz, D. Transforming growth factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications. Mediators of Inflammation. 2015, 137823 (2015).
- Sun, Y., Lu, Y., Hu, Y., Ma, F., Chen, W. Induction of osteogenesis by bovine platelet transforming growth factor-beta (TGF-beta) in adult mouse femur. Chinese Medical Journal (English). 108 (12), 914-918 (1995).
- Sun, X., et al. Anti-miRNA oligonucleotide therapy for chondrosarcoma). Molecular Cancer Therapeutics. 18 (11), 2021-2029 (2019).
- Jayasuriya, C. T., Chen, Y., Liu, W., Chen, Q. The influence of tissue microenvironment on stem cell-based cartilage repair. Annals of the New York Academy of Sciences. 1383 (1), 21-33 (2016).
- Chen, Y., et al. Deficient mechanical activation of anabolic transcripts and post-traumatic cartilage degeneration in matrilin-1 knockout mice. PLoS One. 11 (6), 0156676 (2016).
- Zhou, L., Zhang, W., Lee, J., Kuhn, L., Chen, Y. Controlled self-assembly of DNA-mimicking nanotubes to form a layer-by-layer scaffold for homeostatic tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 13 (43), 51321-51332 (2021).
- Belluoccio, D., Schenker, T., Baici, A., Trueb, B. Characterization of human matrilin-3 (MATN3). Genomics. 53 (3), 391-394 (1998).
- Yau, A., Yu, H., Chen, Y. mRNA detection with fluorescence-base imaging techniques for arthritis diagnosis. Journal of Rheumatology Research. 1 (2), 39-46 (2019).
- Lee, J., Sands, I., Zhang, W., Zhou, L., Chen, Y. DNA-inspired nanomaterials for enhanced endosomal escape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (19), (2021).
- Zhang, W., Chen, Y. Molecular engineering of DNA-inspired Janus base nanomaterials. Juniper Online Journal Material Science. 5 (4), 555670 (2019).
- Yau, A., Sands, I., Chen, Y. Nano-scale surface modifications to advance current treatment options for cervical degenerative disc disease (CDDD). Journal of Orthopedic Research and Therapy. 4 (9), 1147 (2019).
- Mello, M. A., Tuan, R. S. Effects of TGF-beta1 and triiodothyronine on cartilage maturation: in vitro analysis using long-term high-density micromass cultures of chick embryonic limb mesenchymal cells. Journal of Orthopaedic Research. 24 (11), 2095-2105 (2006).
- Shi, Y., Massague, J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell. 113 (6), 685-700 (2003).
- Sands, I., Lee, J., Zhang, W., Chen, Y. RNA delivery via DNA-inspired janus base nanotubes for extracellular matrix penetration. MRS Advances. 5 (16), 815-823 (2020).
- Zhou, L., Rubin, L. E., Liu, C., Chen, Y. Short interfering RNA (siRNA)-based therapeutics for cartilage diseases. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (3), 283-290 (2020).
- Bi, H., et al. Deposition of PEG onto PMMA microchannel surface to minimize nonspecific adsorption. Lab on a Chip. 6 (6), 769-775 (2006).
- Chen, Y., Webster, T. J. Increased osteoblast functions in the presence of BMP-7 short peptides for nanostructured biomaterial applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 91 (1), 296-304 (2009).
- Sun, M., Lee, J., Chen, Y., Hoshino, K. Studies of nanoparticle delivery with in vitro bio-engineered microtissues. Bioactive Materials. 5 (4), 924-937 (2020).
- Yau, A., Lee, J., Chen, Y. Nanomaterials for protein delivery in anticancer applications. Pharmaceutics. 13 (2), 155 (2021).
