Coloration tridimensionnelle des reins entiers avec CUBIC

Résumé

Le présent protocole décrit une méthode de nettoyage tissulaire et une coloration immunofluorescente à montage entier pour l’imagerie rénale tridimensionnelle (3D). Cette technique peut offrir des perspectives macroscopiques en pathologie rénale, conduisant à de nouvelles découvertes biologiques.

Résumé

Bien que la pathologie conventionnelle fournisse de nombreuses informations sur la microstructure rénale, il était difficile de connaître la structure précise des vaisseaux sanguins, des tubules proximaux, des canaux collecteurs, des glomérules et des nerfs sympathiques dans le rein en raison du manque d’informations tridimensionnelles (3D). La compensation optique est une bonne stratégie pour surmonter ce gros obstacle. Plusieurs cellules d’un organe entier peuvent être analysées à une résolution unicellulaire en combinant la clairance tissulaire et la technique d’imagerie 3D. Cependant, les méthodes de marquage cellulaire pour l’imagerie des organes entiers restent sous-développées. En particulier, la coloration des organes entiers est difficile en raison de la difficulté de pénétration des anticorps. Le présent protocole a développé une coloration rénale de souris à montage entier pour l’imagerie 3D avec la méthode de nettoyage tissulaire CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis). Le protocole a permis de visualiser la dénervation sympathique rénale après une lésion d’ischémie-reperfusion et une glomérulomégalie au stade précoce de la maladie rénale diabétique d’un point de vue global. Ainsi, cette technique peut mener à de nouvelles découvertes dans la recherche rénale en fournissant une perspective macroscopique.

Introduction

Le rein est composé de diverses populations cellulaires. Bien que la pathologie conventionnelle nous donne beaucoup d’informations sur le microenvironnement rénal, l’imagerie tridimensionnelle (3D) est nécessaire pour comprendre précisément la diaphonie intercellulaire au cours de la progression de la maladie rénale. Dans le passé, un grand nombre de coupes en série et de reconstruction d’images devaient être effectuées pour l’imagerie 3D de l’organe entier¹. Cependant, cette méthode nécessitait trop d’efforts et présentait des problèmes en termes de reproductibilité.

Le défrichage optique est une bonne stratégie pou....

Protocole

Toutes les expériences ont été approuvées par le comité d’examen institutionnel de l’Université de Tokyo. Toutes les procédures animales ont été effectuées conformément aux directives des National Institutes of Health. Des souris C57BL/6NJcl mâles, âgées de 8 semaines, ont été utilisées pour la présente étude. Les souris ont été obtenues de sources commerciales (voir le tableau des matériaux).

1. Préparation animale et fixation rénale

1. Effectuez la fixation de perfusion en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Anesthésier la souris par inhalation d’isoflurane (3 %, 2,0 L/min) et administration intr....

Résultats

En utilisant cette méthode de coloration, les nerfs sympathiques [anticorps anti-tyrosine hydroxylase (TH)] et les artères [anticorps anti-actine α-muscle lisse (αSMA)] dans un rein entier (Figure 4A, B et Vidéo 1) ont été visualisés⁹. Des nerfs sympathiques rénaux anormaux ont également été visualisés après une lésion d’ischémie/reperfusion (IRI)^9,10 (fig.......

Discussion

Le protocole actuel a permis l’imagerie 3D du rein entier de diverses structures telles que les nerfs sympathiques, les canaux collecteurs, les artères, les tubules proximaux et les glomérules 9,10,11. Cette méthode de coloration offrait une observation macroscopique et conduisait à de nouvelles découvertes biologiques, en visualisant l’altération des nerfs sympathiques rénaux après une lésion d’ischémie-.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
14 mL Round Bottom High Clarity PP Éprouvette	Falcon	352059	Nettoyage des tissus, coloration, lavage
2,3-diméthyl-1-phényl-5-pyrazolone/antipyrine	Tokyo Chemical Industry	D1876	CUBIC-R+
37 %-Formaldéhyde Solution	Nacalai Tesque	16223-55	Post-fixation
%-Paraformaldéhyde Phosphate Buffer Solution	Nacalai Tesque	09154-85	Fixation rénale
Alexa Flour 555-conjugué âne Anticorps IgG anti-mouton	Invitrogen	A-21436	Anticorps secondaire (1:100)
Alexa Flour 647-conjugué âne anti-lapin IgG	Invitrogen	A-31573	Anticorps secondaire (1:200)
Anticorps anti-aquaporine 2 (AQP2)	Abcam	ab199975	Anticorps primaire (1:100)
Anticorps anti-podocine	Sigma-Aldrich	P0372	Anticorps primaire (1:100)
Anticorps anti-cotransporteur de glucose sodique 2 (SGLT2)	Abcam	ab85626	Anticorps primaire (1:100)
Anticorps anti-tyrosine hydroxylase (TH)	Abcam	ab113	Anticorps primaire (1:100)
Anticorps anti-&alpha ;-smooth muscle actin (&alpha ;-SMA) Anticorps	Abcam	ab5694	Anticorps primaire (1:200)
Caséine bloquante dans PBS	Thermo Fisher Scientific	37528	Tampon de coloration
Butorphanol Tartrate	Meiji	005526	Anesthésique
C57BL/6NJcl	Nippon Bio-Supp.Center	N/A	Souche de souris
Imaris	Bitplane	N/A	Logiciel d’analyse d’imagerie
Microscope macro-zoom	OLYMPUS	MVX10	L’unité d’observation du microscope sur mesure
Chlorhydrate de médétomidine	Kyoritsu-Seiyaku	008656	Anesthésique
Midazolam	SANDOZ	27803229	Anesthésique
Huile minérale	Sigma-Aldrich	M8410	Huile d’immersion
N-buthyldiéthanolamine	Tokyo Industrie chimique	B0725	CUBIC-L, CUBIC-R+
Nicotinamide	Tokyo Industrie chimique	N0078	CUBIC-R+
Polyéthylène glycol mono-p-isooctylphényléther / Triton X-100	Nacalai Tesque	12967-45	CUBIC-L, PBST
Huile de silicium HIVAC-F4	Shin-Etsu Huile	chimique 50449832	immersion
Azoture de sodium	Wako	195-11092	Tampon de coloration

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