KÜBİK ile Tüm Böbrek Üç Boyutlu Boyama
Summary
Mevcut protokol, üç boyutlu (3D) böbrek görüntüleme için bir doku temizleme yöntemi ve tam montajlı immünofloresan boyama yöntemini tanımlamaktadır. Bu teknik, böbrek patolojisinde makroskopik perspektifler sunarak yeni biyolojik keşiflere yol açabilir.
Abstract
Konvansiyonel patoloji böbrek mikroyapısı hakkında çok sayıda bilgi vermesine rağmen, üç boyutlu (3D) bilgi eksikliği nedeniyle böbrekteki kan damarlarının, proksimal tübüllerin, toplama kanallarının, glomerüllerin ve sempatik sinirlerin kesin yapısını bilmek zordu. Optik temizleme, bu büyük engelin üstesinden gelmek için iyi bir stratejidir. Bütün bir organdaki çoklu hücreler, doku temizleme ve 3D görüntüleme tekniği birleştirilerek tek hücre çözünürlüğünde analiz edilebilir. Bununla birlikte, tüm organ görüntüleme için hücre etiketleme yöntemleri az gelişmiş kalmaktadır. Özellikle, antikor penetrasyonundaki zorluk nedeniyle tüm organ boyama zordur. Mevcut protokol, CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis) doku temizleme yöntemi ile 3D görüntüleme için tam montajlı bir fare böbrek boyama geliştirdi. Protokol, iskemi-reperfüzyon hasarı sonrası renal sempatik denervasyonun ve diyabetik böbrek hastalığının erken evresinde glomerülomegalinin kapsamlı bir bakış açısıyla görselleştirilmesini sağlamıştır. Böylece, bu teknik makroskopik bir bakış açısı sağlayarak böbrek araştırmalarında yeni keşiflere yol açabilir.
Introduction
Böbrek çeşitli hücre popülasyonlarından oluşur. Konvansiyonel patoloji bize böbrek mikroçevresi hakkında çok fazla bilgi vermesine rağmen, böbrek hastalığı progresyonu sırasında hücreler arası çapraz konuşmayı tam olarak anlamak için üç boyutlu (3D) görüntülemeye ihtiyaç vardır. Geçmişte, tüm organ 3D görüntüleme1 için çok sayıda seri kesitleme ve görüntü rekonstrüksiyonu yapılması gerekiyordu. Ancak bu yöntem çok fazla çaba gerektiriyordu ve tekrarlanabilirlik açısından sorunlar yaşıyordu.
Optik temizleme, bu engelin üstesinden gelmek için iyi bir stratejidir 2,3. Doku opaklığı esas olarak ışık saçılması ve emiliminden kaynaklanır, çünkü her organ su, protein ve lipitler dahil olmak üzere çeşitli maddelerden oluşur. Bu nedenle, doku temizlemenin temel stratejisi, dokulardaki su ve lipitleri, proteinlerle aynı optik özelliklere sahip kırılma indisi (RI) eşleşen reaktiflerle değiştirmektir4. Şeffaf bir örneği gözlemlemek için, hafif bir tabaka floresan mikroskobu yararlıdır5. Işık tabakaları şeffaf numuneyi yandan aydınlatır ve uyarma sinyalleri dikey konumda bulunan objektif lens aracılığıyla elde edilir6. Bu mikroskopi, konfokal veya multifoton floresan mikroskopisinden farklı olan tek bir taramada kesit bilgisi elde eder. Böylece, düşük fotobeyazlatma seviyesine sahip z-stack görüntülerini hızlı bir şekilde elde edebilir.
Net, Engelsiz Beyin/Vücut Görüntüleme Kokteylleri ve Hesaplamalı Analiz (CUBIC), ışık tabakası floresan mikroskobuile tüm organların görüntülenmesini sağlayan doku temizleme yöntemlerinden biridir 2,7,8. KÜBİK ve tam montajlı immünofloresan boyama, fare böbrek 3D yapılarını görselleştirmek için bu çalışmada optimize edilmiştir 9,10,11. Bu bütünsel boyama yöntemini kullanarak, böbrek sempatik sinirlerindeki değişiklik, diyabetikböbrek hastalığı 11’in erken evresinde iskemi-reperfüzyon hasarı 9,10 ve glomerülomegaliden sonra, ayrıca kan damarları, proksimal tübüller ve bütün bir böbrekte toplama kanalları9 olarak görselleştirilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut protokol, sempatik sinirler, toplama kanalları, arterler, proksimal tübüller ve glomerüller 9,10,11 gibi çeşitli yapıların tüm böbrek 3D görüntülenmesine izin verdi. Bu boyama yöntemi, iskemi-reperfüzyon hasarı 9,10 ve diyabetik böbrek hastalığının ilk aşamasında glomerülomegali sonrası renal sempatik sinirlerdeki değişimi görselleştirerek makroskopik gözlem…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmanın bir kısmı Prof. Hiroki R. Ueda (Tokyo Üniversitesi), Prof. Etsuo A. Susaki (Juntendo Üniversitesi), Prof. Tetsuhiro Tanaka (Tohoku Üniversitesi), Prof. Masafumi Fukagawa, Dr. Takehiko Wada ve Dr. Hirotaka Komaba (Tokai Üniversitesi) ile işbirliği içinde yürütülmüştür.
Materials
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube | Falcon | 352059 | Tissue clearing, staining, wash |
| 2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine | Tokyo Chemical Industry | D1876 | CUBIC-R+ |
| 37%-Formaldehyde Solution | Nacalai Tesque | 16223-55 | Post fixation |
| 4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Nacalai Tesque | 09154-85 | Kidney fixation |
| Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody | Invitrogen | A-21436 | Secondary antibody (1:100) |
| Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | A-31573 | Secondary antibody (1:200) |
| Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody | Abcam | ab199975 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-podocin antibody | Sigma-Aldrich | P0372 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody | Abcam | ab85626 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody | Abcam | ab113 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody | Abcam | ab5694 | Primary antibody (1:200) |
| Blocker Casein in PBS | Thermo Fisher Scientific | 37528 | Staining buffer |
| Butorphanol Tartrate | Meiji | 005526 | Anesthetic |
| C57BL/6NJcl | Nippon Bio-Supp.Center | N/A | Mouse strain |
| Imaris | Bitplane | N/A | Imaging analysis software |
| Macro-zoom microscope | OLYMPUS | MVX10 | The observation unit of the custom-built microscope |
| Medetomidine Hydrochloride | Kyoritsu-Seiyaku | 008656 | Anesthetic |
| Midazolam | SANDOZ | 27803229 | Anesthetic |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Immersion oil |
| N-buthyldiethanolamine | Tokyo Chemical Industry | B0725 | CUBIC-L, CUBIC-R+ |
| Nicotinamide | Tokyo Chemical Industry | N0078 | CUBIC-R+ |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | CUBIC-L, PBST |
| Silicon oil HIVAC-F4 | Shin-Etsu Chemical | 50449832 | Immersion oil |
| Sodium azide | Wako | 195-11092 | Staining buffer |
References
- Velez-Fort, M., et al. The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing. Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Tainaka, K., et al. Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Hasegawa, S., et al. Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury. Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).
- Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. Neuroimmune interactions and kidney disease. Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).
- Hasegawa, S., et al. The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease. Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hasegawa, S., et al. Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury. Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).
