في المختبر فحص خلايا الدم الحمراء المصابة بالبلازموديوم التي تقتلها الخلايا الليمفاوية السامة للخلايا
Summary
نصف هنا طريقة جديدة للمساعدة في توضيح آليات المناعة الخلوية للبلازميوم خلال مرحلة الدم من العدوى. هذا اختبار في المختبر يقيس قتل خلايا الدم الحمراء المصابة بواسطة الخلايا الليمفاوية السامة للخلايا.
Abstract
الملاريا هي مصدر قلق رئيسي للصحة العامة ، حيث تقدم أكثر من 200 مليون حالة سنويا في جميع أنحاء العالم. على الرغم من سنوات من الجهود العلمية ، لا تزال المناعة الوقائية للملاريا غير مفهومة بشكل جيد ، ويرجع ذلك أساسا إلى القيود المنهجية لثقافة البلازموديوم طويلة الأجل ، وخاصة بالنسبة للمتصورة النشيطة. ركزت معظم الدراسات على حماية المناعة التكيفية ضد الملاريا بواسطة الأجسام المضادة ، والتي تلعب دورا رئيسيا في السيطرة على الملاريا. ومع ذلك ، فإن الحماية المعقمة التي تسببها لقاحات Plasmodium sporozoites الموهنة مرتبطة بالاستجابة الخلوية ، بشكل رئيسي للخلايا الليمفاوية التائية السامة ، مثل خلايا CD8 + وخلايا جاما دلتا تي (γδ T). وبالتالي ، يجب تطوير منهجيات جديدة لفهم وظائف الاستجابة المناعية الخلوية بشكل أفضل وبالتالي دعم العلاج المستقبلي وتطوير اللقاح. لإيجاد استراتيجية جديدة لتحليل هذه المناعة الخلوية لعدوى مرحلة الدم بالمتصورة ، أنشأت مجموعتنا مقايسة في المختبر تقيس قتل خلايا الدم الحمراء المصابة (iRBC) بواسطة الخلايا الليمفاوية السامة للخلايا. يمكن استخدام هذا الفحص لدراسة آليات الاستجابة المناعية الخلوية ضد المتصورة المختلفة في مرحلة الدم. يمكن للخلايا المناعية السامة للخلايا الفطرية والتكيفية القضاء مباشرة على iRBCs والطفيلي داخل الخلايا في آلية المستجيب: الهدف. يتم تصنيف iRBCs المستهدفة لتقييم صلاحية الخلية ، ويتم زراعتها مع الخلايا المستجيبة (خلايا CD8 + T ، γδ T ، NK ، إلخ). يتم حساب نسبة التحلل بناء على الظروف المختبرة ، مقارنة بالتحكم في التحلل التلقائي في الفحص القائم على قياس التدفق الخلوي. في نهاية المطاف ، تعد منهجية فحص القتل هذه تقدما كبيرا في فهم المناعة الخلوية للملاريا في مرحلة الدم ، مما يساعد على الكشف عن أهداف علاجية محتملة جديدة وتسريع تطوير لقاحات الملاريا.
Introduction
لا تزال الملاريا تمثل أزمة صحية عالمية ، حيث تم الإبلاغ عن أكثر من 240 مليون حالة و 627000 حالة وفاة مرتبطة بالملاريا في عام 20201. يوجد حاليا خمسة أنواع طفيلية يمكن أن تسبب الملاريا لدى البشر ، منها المتصورة المنجلية والمتصورة النشيطة هما النوعان الأكثر انتشارا. أثناء عدوى المتصورة ، يكون الكبد أو مرحلة ما قبل كرات الدم الحمراء بدون أعراض ، وتحدث الأعراض فقط أثناء الدورة اللاجنسية للطفيلي في مرحلة كرات الدم الحمراء. في مرحلة العدوى هذه ، يتم إطلاق الآلاف من الميروزويتات المشتقة من مرحلة الكبد في مجرى الدم وتصيب خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء). في كرات الدم الحمراء ، تتمايز الطفيليات إلى تروفوزويتات وشيزونتس عن طريق الفصام ، حتى تمزق الفصام كريات الدم الحمراء ، وتطلق الميروزويت المشكلة حديثا ، مكررة دورة الدم هذه. تؤدي الدورات المتكررة للغزو والتكرار وإطلاق الميروزويت إلى نمو هائل في عدد الطفيليات وتؤدي في النهاية إلى ظهور أعراض المرض2.
أحد التحديات المهمة في دراسة الاستجابة المناعية للملاريا هو أن المتصورة النيابة. التي تصيب البشر لا تصيب نماذج المختبر. وبالتالي ، يجب جمع عينات المرضى المصابين بالبلازموديوم طازجة ومعالجتها وتحليلها على الفور. ومع ذلك، في المناطق الموبوءة بالملاريا، تكون الموارد المتاحة للوصول إلى الآليات المناعية والجزيئية محدودة. بسبب هذه القيود ، تستخدم القوارض على نطاق واسع كنماذج تجريبية للتحقيق في الاستجابة المناعية ضد عدوى البلازموديوم. في حين أن P. berghei و P. chabaudi غالبا ما يستخدمان كبدائل لعدوى P. falciparum ، فإن السلالة غير المميتة من P. yoelii 17XNL لها أيضا العديد من الميزات المشتركة مع P. vivax ، مثل العدوى الشبكيةالمقيدة 3,4. إن تطوير مقايسات البلازموديوم في المختبر ، والتي يمكن استخدامها للعينات المشتقة من النماذج البشرية أو الحيوانية ، له قيمة في اكتساب فهم أفضل للتسبب في الملاريا ومقارنة الاستجابة المناعية التي تثيرها الأنواع المختلفة من الطفيلي.
المناعة الوقائية المضادة للملاريا ليست مفهومة تماما سواء في مرحلة ما قبل كريات الدم الحمراء ولا في مرحلة الدم. من المعروف أن التعرض للعدوى المتكررة يؤدي إلى مناعة مكتسبة جزئية ، ولكن نادرا ما يتم تطوير المناعة المعقمة5. لعقود من الزمان ، ارتبطت المناعة الوقائية المضادة للبلازموديوم بشكل أساسي بتحريض الأجسام المضادة المعادلة أو المرئية التي تمنع غزو الطفيليات للخلايا المضيفة أو تؤدي إلى البلعمة بواسطة الخلايا المقدمة للمستضد ، على التوالي6. ونتيجة لذلك، اعتمدت معظم الجهود المبذولة لإنتاج لقاحات مضادة للملاريا حتى الآن على تحفيز الأجسام المضادة الوقائية وطويلة الأمد 7,8. ومع ذلك ، فإن الحماية المعقمة الناجمة عن التطعيم مع sporozoite الموهن ترتبط ارتباطا مباشرا مع تنشيط وتوسيع الخلايا الليمفاوية التائية السامةللخلايا 8,9.
في الآونة الأخيرة ، أظهرت بعض الدراسات التي أجريت على عينات المرضى المعزولة حديثا والثقافات في المختبر أن الخلايا المناعية السامة للخلايا الفطرية أو التكيفية مثل CD8 + T10 و γδ T 11 و NK12 يمكن أن تقضي مباشرة على كرات الدم الحمراء المصابة بالبلازموديوم وطفيلياتها داخل الخلايا بطريقة المستجيب: النسبة المستهدفة. حددت هذه النتائج الأساسية آلية مستجيب مناعي جديدة تماما في سياق الملاريا. لتشريح هذه المناعة الجديدة المضادة للملاريا ، من الضروري استكشاف آليات المستجيب السام للخلايا القاتلة ضد كرات الدم الحمراء المصابة (iRBCs) في العدوى الطبيعية أو التطعيم.
نقدم هنا مقايسة في المختبر تقيس النشاط السام للخلايا الليمفاوية ضد الملاريا في مرحلة الدم. يمكن أن يساعد هذا الفحص بعد ذلك في توضيح آليات الاستجابة المناعية الخلوية ضد مرحلة كريات الدم الحمراء المتصورة . يتم تمييز الخلايا المستهدفة ، iRBCs ، بإستر كربوكسي فلوريسئين سكسينيميديل (CFSE) لتقييم صلاحية الخلية ، ثم يتم زراعتها مع الخلايا المستجيبة مثل الخلايا الليمفاوية السامة للخلايا (CTL). ثم يتم تقييم هذه الثقافة المشتركة عن طريق قياس التدفق الخلوي ، باستخدام علامات الفلورسنت لأنواع معينة من الخلايا. أخيرا ، يتم حساب النسبة المئوية لتحلل iRBC بواسطة CTL بقسمة الحالة التجريبية على التمزق التلقائي لكرات الدم الحمراء والتحكم في التحلل التلقائي ، والذي يحدث أثناء الحضانة بدون الخلية المستجيبة. بشكل عام ، يمكن أن تساهم منهجية فحص القتل هذه في فهم أفضل لمناعة الملاريا بوساطة الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
نصف هنا مقايسة في المختبر لقياس قتل خلايا الدم الحمراء المصابة بالبلازموديوم بواسطة الخلايا الليمفاوية السامة. يمكن أن يساعد هذا الفحص في توضيح آليات المناعة الخلوية الوقائية لمرحلة كريات الدم الحمراء لطفيلي الملاريا. الميزة الرئيسية لهذه المنهجية هي أنها توفر مقايسة كمية للق…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور ديليو بيريرا وأعضاء مركز أبحاث الطب الاستوائي في روندونيا (CEPEM) على تسجيل مرضى الملاريا وجمع الدم وفيليسيا هو للمساعدة في مراجعة المخطوطات. تم الحصول على الكاشف التالي من خلال BEI Resources و NIAID و NIH: Plasmodium yoelii subsp. yoelii ، Strain 17XNL: PyGFP ، MRA- 817 ، بمساهمة آنا رودريغيز. تم دعم هذا البحث من قبل صندوق ليمان البرازيل للأبحاث ، والمجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجية (CNPq) – 437851 / 2018-4 ، والزمالات (CJ ، GC ، CG) ، ومؤسسة أمبارو دو إستادو دي ميناس جيرايس (FAPEMIG) – APQ-00653-16 ، APQ-02962-18 ؛ Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – زمالة (LL).
Materials
| 100 μM cell strainer | Corning | 431752 | |
| 96 Well Round (U) Bottom Plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | |
| Anti-human CD235a (Glycophorin A) Antibody | Biolegend | 349114 | Used – APC anti-human CD235, dilution 1:100 |
| Anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317314 | Used – PB anti-human CD3, dilution 1:200 |
| Anti-human CD8 Antibody | Biolegend | 344714 | Used – APC/Cy7 anti-human CD8, dilution 1:200 |
| Anti-human TCR Vδ2 Antibody | Biolegend | 331408 | Used – PE anti-human TCR Vδ2, dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100733 | Used- PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a, dilution 1:200 |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody | Biolegend | 116223 | Used – APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119, dilution 1:200 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | Gibco | 26140079 | |
| Ficoll-Paque Plus | Cytiva | 17144003 | Lymphocyte Separation Medium (LSM) |
| Heparin Sodium Injection, USP | meithel pharma | 71228-400-003 | Used – 2000 USP units/2mL |
| Isoflurane | Piramal critical care | 66794-0013-25 | |
| LS MACS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSRFortessa Cell Analyzer | BD Bioscience | ||
| Percoll | Cytiva | 17089101 | Density Gradient Separation Medium (DGSM) |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | |
| Sodium bicarbonate, powder, BioReagent | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Syringe With Sub-Q needle – 1mL, 26 gauge; | BD | 14-829-10F | |
| Vacutainer Heparin Tube Glass Green 10 ml | BD | 366480 |
References
- WHO. Global Technical Strategy for Malaria 2016-2030, 2021 Update. World Health Organization. , (2021).
- Hafalla, J. C., Silvie, O., Matuschewski, K. Cell biology and immunology of malaria. Immunological Reviews. 240 (1), 297-316 (2011).
- Belnoue, E., et al. Vaccination with live Plasmodium yoelii blood stage parasites under chloroquine cover induces cross-stage immunity against malaria liver stage. Journal of Immunology. 181 (12), 8552-8558 (2008).
- Leong, Y. W., Lee, E. Q. H., Rénia, L., Malleret, B. Rodent malaria erythrocyte preference assessment by an ex vivo tropism assay. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 680136 (2021).
- Ladeia-Andrade, S., Ferreira, M. U., De Carvalho, M. E., Curado, I., Coura, J. R. Age-dependent acquisition of protective immunity to malaria in riverine populations of the amazon basin of Brazil. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 80 (3), 452-459 (2009).
- Antonelli, L. R., et al. The immunology of Plasmodium vivax malaria. Immunological Reviews. 293 (1), 163-189 (2020).
- Kazmin, D., et al. Systems analysis of protective immune responses to RTS, S malaria vaccination in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2425-2430 (2017).
- Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8+ T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
- Draper, S. J., et al. Malaria vaccines: recent advances and new horizons. Cell Host & Microbe. 24 (1), 43-56 (2018).
- Junqueira, C., et al. γδ T cells suppress Plasmodium falciparum blood-stage infection by direct killing and phagocytosis. Nature Immunology. 22 (3), 347-357 (2021).
- Junqueira, C., et al. Cytotoxic CD8+ T cells recognize and kill Plasmodium vivax-infected reticulocytes. Nature Medicine. 24 (9), 1330-1336 (2018).
- Arora, G., et al. NK cells inhibit Plasmodium falciparum growth in red blood cells via antibody-dependent cellular cytotoxicity. eLife. 7, 36806 (2018).
- Paul, F., Roath, S., Melville, D., Warhurst, D. C., Osisanya, J. O. S. Separation of malaria-infected erythrocytes from whole blood: use of a selective high-gradient magnetic separation technique. Lancet. 2 (8237), 70-71 (1981).
- Shaw-Saliba, K., et al. Insights into an optimization of Plasmodium vivax Sal-1 in vitro culture: the aotus primate model. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), 0004870 (2016).
- Mehlotra, R. K., et al. Long-term in vitro culture of Plasmodium vivax isolates from Madagascar maintained in Saimiri boliviensis blood. Malaria Journal. 16 (1), 442 (2017).
- Hojo-Souza, N. S., et al. Contributions of IFN-γ and granulysin to the clearance of Plasmodium yoelii blood stage. PLOS Pathogens. 16 (9), 1008840 (2020).
- Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J. C., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Current Protocols in Immunology. 84 (1), 4-9 (2009).
- Migliaccio, A. R. Erythroblast enucleation. Haematologica. 95 (12), 1985 (2010).
- Grimberg, B. T., Erickson, J. J., Sramkoski, R. M., Jacobberger, J. W., Zimmerman, P. A. Monitoring Plasmodium falciparum growth and development by UV flow cytometry using an optimized Hoechst-thiazole orange staining strategy. Cytometry Part A:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 73 (6), 546-554 (2008).
- Pattanapanyasat, K., et al. Culture of malaria parasites in two different red blood cell populations using biotin and flow cytometry. Cytometry:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 25 (3), 287-294 (1996).
- Bianco, A. E., Battye, F. L., Brown, G. V. Plasmodium falciparum: rapid quantification of parasitemia in fixed malaria cultures by flow cytometry. Experimental Parasitology. 62 (2), 275-282 (1986).
- Jacobberger, J. W., Horan, P. K., Hare, J. D. Analysis of malaria parasite-infected blood by flow cytometry. Cytometry:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 4 (3), 228-237 (1983).
- Bei, A. K., et al. A flow cytometry-based assay for measuring invasion of red blood cells by Plasmodium falciparum. American Journal of Hematology. 85 (4), 234 (2010).
- Montes, M., Jaensson, E. A., Orozco, A. F., Lewis, D. E., Corry, D. B. A general method for bead-enhanced quantitation by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 317 (1-2), 45-55 (2006).
