Summary

במבחנה בדיקה של הרג תאי דם אדומים נגועים בפלסמודיום על ידי לימפוציטים ציטוטוקסיים

Published: August 17, 2022
doi:

Summary

כאן אנו מתארים שיטה חדשה כדי לעזור להבהיר את מנגנוני החסינות התאית פלסמודיום בשלב הדם של זיהום. זוהי בדיקת מבחנה המודדת הרג תאי דם אדומים נגועים על ידי לימפוציטים ציטוטוקסיים.

Abstract

מלריה היא דאגה מרכזית לבריאות הציבור, ומציגה יותר מ -200 מיליון מקרים בשנה ברחבי העולם. למרות שנים של מאמצים מדעיים, חסינות מגינה למלריה עדיין אינה מובנת, בעיקר בשל מגבלות מתודולוגיות של תרבית פלסמודיום ארוכת טווח, במיוחד עבור פלסמודיום vivax. רוב המחקרים התמקדו בהגנה על מערכת החיסון הנרכשת מפני מלריה על ידי נוגדנים, הממלאים תפקיד מפתח בשליטה במלריה. עם זאת, ההגנה הסטרילית המושרה על ידי חיסונים מוחלשים נגד פלסמודיום ספורוזואיטים קשורה לתגובה תאית, בעיקר ללימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T, כגון CD8+ ותאי T מסוג גמא דלתא (γδ T). לפיכך, יש לפתח מתודולוגיות חדשות כדי להבין טוב יותר את הפונקציות של התגובה החיסונית התאית ובכך לתמוך בטיפול עתידי ופיתוח חיסונים. כדי למצוא אסטרטגיה חדשה לניתוח חסינות תאית זו לזיהום פלסמודיום בשלב הדם, הקבוצה שלנו הקימה בדיקה במבחנה המודדת הרג תאי דם אדומים נגועים (iRBC) על ידי לימפוציטים ציטוטוקסיים. בדיקה זו יכולה לשמש לחקר מנגנוני תגובה חיסונית תאית נגד פלסמודיום spp. שונים בשלב הדם. תאי חיסון ציטוטוקסיים מולדים ונרכשים יכולים לחסל ישירות iRBCs ואת הטפיל התוך-תאי במנגנון effector:target. iRBCs מטרה מסומנים כדי להעריך את כדאיות התא, ומתורבת יחד עם תאי אפקט (CD8+ T, γδ T, תאי NK וכו ‘). אחוז הליזה מחושב על בסיס התנאים שנבדקו, בהשוואה לבקרת ליזה ספונטנית בבדיקה מבוססת ציטומטריית זרימה. בסופו של דבר, מתודולוגיית בדיקת הרג זו היא התקדמות משמעותית בהבנת חסינות תאית למלריה בשלב הדם, ומסייעת לחשוף מטרות טיפוליות פוטנציאליות חדשות ולהאיץ את הפיתוח של חיסונים נגד מלריה.

Introduction

המלריה נותרה משבר בריאותי עולמי, עם יותר מ -240 מיליון מקרים ו -627,000 מקרי מוות הקשורים למלריה שדווחו בשנת 20201. כיום ישנם חמישה מינים טפיליים שיכולים לגרום למלריה בבני אדם, מתוכם פלסמודיום פלציפרום ופלסמודיום ויווקס הם שני המינים הנפוצים ביותר. במהלך זיהום פלסמודיום, הכבד או השלב הפרה-אריתרוציטי הוא אסימפטומטי, והתסמינים מתרחשים רק במהלך המחזור הא-מיני של הטפיל בשלב האריתרוציטי. בשלב זיהום זה, אלפי מרוזואיטים שמקורם בשלב הכבד משתחררים לזרם הדם ומדביקים תאי דם אדומים (RBC). ב RBC, הטפילים להבדיל trophozoites ו schizonts על ידי schizogony, עד schizonts לקרוע את אריתרוציטים, שחרור merozoites שזה עתה נוצרו, חוזר על מחזור הדם הזה. מחזורים חוזרים ונשנים של פלישה, שכפול ושחרור מרוזואיטים גורמים לגידול אקספוננציאלי באוכלוסיית הטפילים ובסופו של דבר מעוררים תסמיני מחלה2.

אתגר חשוב בחקר התגובה החיסונית למלריה הוא כי פלסמודיום spp. שמדביק בני אדם אינו מדביק מודלים של חיות מעבדה. לפיכך, דגימות חולים נגועים פלסמודיום חייב להיאסף טרי מיד מעובד ומנותח. עם זאת, באזורים אנדמיים למלריה, המשאבים לגישה למנגנונים אימונולוגיים ומולקולריים מוגבלים. בשל מגבלות אלה, מכרסמים נמצאים בשימוש נרחב כמודלים ניסיוניים כדי לחקור את התגובה החיסונית נגד זיהום פלסמודיום. בעוד P. berghei ו- P. chabaudi משמשים לעתים קרובות כפונדקאיות לזיהום P. falciparum, לזן הלא קטלני של P. yoelii 17XNL יש גם תכונות רבות במשותף עם P. vivax, כגון זיהום מוגבל רטיקולוציטים 3,4. הפיתוח של מבחני פלסמודיום במבחנה, שניתן להשתמש בהם עבור דגימות שמקורן במודלים אנושיים או בעלי חיים, הוא בעל ערך בהשגת הבנה טובה יותר של הפתוגנזה של מלריה והשוואת התגובה החיסונית המתעוררת על ידי מינים שונים של הטפיל.

חסינות מגן נגד מלריה אינו מובן לחלוטין לא בשלב טרום אריתרוציטי ולא בשלב הדם. ידוע כי חשיפה לזיהומים חוזרים גורמת לחסינות נרכשת חלקית, אך חסינות סטרילית כמעט ולא מתפתחת5. במשך עשרות שנים, חסינות מגן נגד פלסמודיום היה קשור בעיקר עם אינדוקציה של נוגדנים מנטרלים או opsonizing המונעים פלישת טפילים של תאים מארחים או להוביל phagocytosis על ידי תאים מציגי אנטיגן, בהתאמה6. כתוצאה מכך, רוב המאמצים לייצר חיסונים נגד מלריה עד כה הסתמכו על השראת נוגדנים מגנים וארוכי טווח 7,8. עם זאת, ההגנה הסטרילית המושרה על ידי חיסון עם ספורוזואיט מוחלש מתואמת ישירות עם הפעלה והרחבה של לימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T 8,9.

לאחרונה, כמה מחקרים של דגימות חולים שבודדו לאחרונה ותרביות במבחנה הוכיחו כי תאים חיסוניים ציטוטוקסיים מולדים או אדפטיביים כמו CD8+ T10, γδ T 11 ותאי NK12 יכולים לחסל ישירות RBCs נגועים בפלסמודיום ואת הטפיל התוך-תאי שלו באופן של יחס אפקטור:מטרה. ממצאים ראשוניים אלה הגדירו מנגנון השפעה חיסוני חדש לחלוטין בהקשר של מלריה. כדי לנתח את החסינות החדשה הזו נגד מלריה, חיוני לחקור מנגנוני השפעה ציטוטוקסיים של תאי הרג נגד RBCs נגועים (iRBCs) בזיהום טבעי או חיסון.

כאן אנו מציגים בדיקה חוץ גופית המודדת את הפעילות ציטוטוקסית של לימפוציטים נגד מלריה בשלב הדם. בדיקה זו יכולה לעזור להבהיר את מנגנוני התגובה החיסונית התאית נגד שלב אריתרוציטים פלסמודיום . תאי המטרה, iRBCs, מסומנים ב-carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) כדי להעריך את כדאיות התא, ולאחר מכן עוברים תרבית משותפת עם תאים משפיעים כמו לימפוציטים ציטוטוקסיים (CTL). תרבות משותפת זו מוערכת לאחר מכן על ידי ציטומטריית זרימה, תוך שימוש בסמנים פלואורסצנטיים עבור סוגי תאים ספציפיים. לבסוף, אחוז הליזה iRBC על ידי CTL מחושב על ידי חלוקת מצב הניסוי על ידי קרע ספונטני של RBCs ובקרת ליזה ספונטנית, המתרחשת במהלך הדגירה ללא התא המשפיע. בסך הכל, מתודולוגיית בדיקת הרג זו יכולה לתרום להבנה טובה יותר של חסינות מלריה בתיווך תאים.

Protocol

כל ההליכים נערכו בהתאם למדיניות קרן אוסוולדו קרוז והמועצה האתית הלאומית (CAAE: 59902816.7.0000.5091). הפרוטוקולים האנושיים פותחו בשיתוף פעולה עם קבוצת המחקר הקליני ממרכז המחקר לרפואה טרופית של רונדוניה (CEPEM), שהיה אחראי על רישום החולים למחקר. התקבלה הסכמה מדעת מכל החולים. לצורך המחקר בב…

Representative Results

כאן מתוארת המתודולוגיה היישומית לבידוד RBCs נגועים בפלסמודיום עם CFSE בבדיקת תרבות משותפת עם לימפוציטים ציטוטוקסיים. ראשית, אנו מספקים ייצוג סכמטי של אופן ביצוע הפרוטוקול, תוך שימוש בדגימות אנושיות שנדבקו ב-P. vivax (איור 1). לאחר מכן, תרשים זרימה מאויר כיצד להמשיך עם הפר…

Discussion

כאן אנו מתארים בדיקת מבחנה למדידת הרג תאי דם אדומים נגועים בפלסמודיום על ידי לימפוציטים ציטוטוקסיים. בדיקה זו יכולה לעזור להבהיר את מנגנוני ההגנה התאית לשלב האריתרוציטי של טפיל המלריה. היתרון העיקרי של מתודולוגיה זו הוא שהיא מספקת בדיקה כמותית של הרג בתיווך תאים של iRBCs שניתן להש…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לד”ר דליו פריירה ולחברי מרכז המחקר לרפואה טרופית של רונדוניה (CEPEM) על רישום חולי מלריה ואיסוף דם ולפלישיה הו על עזרתם בתיקון כתב היד. המגיב הבא הושג באמצעות BEI Resources, NIAID, NIH: Plasmodium yoelii subsp. yoelii, זן 17XNL:PyGFP, MRA- 817, נתרם על ידי אנה רודריגז. מחקר זה נתמך על ידי קרן המחקר Lemann Brazil, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) – 437851/2018-4, מלגות (CJ, GC, CG), ו- Fundação de Amparo do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) – APQ-00653-16, APQ-02962-18; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – fellowship (LL).

Materials

100 μM cell strainer Corning 431752
96 Well Round (U) Bottom Plate  Thermo Scientific 12-565-65
Anti-human CD235a (Glycophorin A) Antibody Biolegend 349114 Used – APC anti-human CD235, dilution 1:100
Anti-human CD3 Antibody Biolegend 317314 Used – PB anti-human CD3, dilution 1:200
Anti-human CD8 Antibody Biolegend 344714 Used – APC/Cy7 anti-human CD8, dilution 1:200
Anti-human TCR Vδ2 Antibody Biolegend 331408 Used – PE anti-human TCR Vδ2, dilution 1:200
Anti-mouse CD8a Antibody  Biolegend 100733 Used- PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a, dilution 1:200
Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody Biolegend 116223 Used – APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119, dilution 1:200
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit Invitrogen C34554
Fetal Bovine Serum, qualified Gibco 26140079
Ficoll-Paque Plus  Cytiva 17144003 Lymphocyte Separation Medium (LSM)
Heparin Sodium Injection, USP meithel pharma 71228-400-003 Used – 2000 USP units/2mL
Isoflurane  Piramal critical care  66794-0013-25
LS MACS Column Miltenyi Biotec 130-042-401
LSRFortessa Cell Analyzer BD Bioscience 
Percoll Cytiva 17089101 Density Gradient Separation Medium (DGSM)
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
RPMI 1640 Medium Gibco 11875093
Sodium bicarbonate, powder,  BioReagent Sigma-Aldrich   S5761
Syringe With Sub-Q needle – 1mL, 26 gauge;  BD 14-829-10F
Vacutainer Heparin Tube Glass Green 10 ml  BD 366480

References

  1. WHO. Global Technical Strategy for Malaria 2016-2030, 2021 Update. World Health Organization. , (2021).
  2. Hafalla, J. C., Silvie, O., Matuschewski, K. Cell biology and immunology of malaria. Immunological Reviews. 240 (1), 297-316 (2011).
  3. Belnoue, E., et al. Vaccination with live Plasmodium yoelii blood stage parasites under chloroquine cover induces cross-stage immunity against malaria liver stage. Journal of Immunology. 181 (12), 8552-8558 (2008).
  4. Leong, Y. W., Lee, E. Q. H., Rénia, L., Malleret, B. Rodent malaria erythrocyte preference assessment by an ex vivo tropism assay. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 680136 (2021).
  5. Ladeia-Andrade, S., Ferreira, M. U., De Carvalho, M. E., Curado, I., Coura, J. R. Age-dependent acquisition of protective immunity to malaria in riverine populations of the amazon basin of Brazil. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 80 (3), 452-459 (2009).
  6. Antonelli, L. R., et al. The immunology of Plasmodium vivax malaria. Immunological Reviews. 293 (1), 163-189 (2020).
  7. Kazmin, D., et al. Systems analysis of protective immune responses to RTS, S malaria vaccination in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2425-2430 (2017).
  8. Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8+ T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
  9. Draper, S. J., et al. Malaria vaccines: recent advances and new horizons. Cell Host & Microbe. 24 (1), 43-56 (2018).
  10. Junqueira, C., et al. γδ T cells suppress Plasmodium falciparum blood-stage infection by direct killing and phagocytosis. Nature Immunology. 22 (3), 347-357 (2021).
  11. Junqueira, C., et al. Cytotoxic CD8+ T cells recognize and kill Plasmodium vivax-infected reticulocytes. Nature Medicine. 24 (9), 1330-1336 (2018).
  12. Arora, G., et al. NK cells inhibit Plasmodium falciparum growth in red blood cells via antibody-dependent cellular cytotoxicity. eLife. 7, 36806 (2018).
  13. Paul, F., Roath, S., Melville, D., Warhurst, D. C., Osisanya, J. O. S. Separation of malaria-infected erythrocytes from whole blood: use of a selective high-gradient magnetic separation technique. Lancet. 2 (8237), 70-71 (1981).
  14. Shaw-Saliba, K., et al. Insights into an optimization of Plasmodium vivax Sal-1 in vitro culture: the aotus primate model. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), 0004870 (2016).
  15. Mehlotra, R. K., et al. Long-term in vitro culture of Plasmodium vivax isolates from Madagascar maintained in Saimiri boliviensis blood. Malaria Journal. 16 (1), 442 (2017).
  16. Hojo-Souza, N. S., et al. Contributions of IFN-γ and granulysin to the clearance of Plasmodium yoelii blood stage. PLOS Pathogens. 16 (9), 1008840 (2020).
  17. Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J. C., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Current Protocols in Immunology. 84 (1), 4-9 (2009).
  18. Migliaccio, A. R. Erythroblast enucleation. Haematologica. 95 (12), 1985 (2010).
  19. Grimberg, B. T., Erickson, J. J., Sramkoski, R. M., Jacobberger, J. W., Zimmerman, P. A. Monitoring Plasmodium falciparum growth and development by UV flow cytometry using an optimized Hoechst-thiazole orange staining strategy. Cytometry Part A:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 73 (6), 546-554 (2008).
  20. Pattanapanyasat, K., et al. Culture of malaria parasites in two different red blood cell populations using biotin and flow cytometry. Cytometry:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 25 (3), 287-294 (1996).
  21. Bianco, A. E., Battye, F. L., Brown, G. V. Plasmodium falciparum: rapid quantification of parasitemia in fixed malaria cultures by flow cytometry. Experimental Parasitology. 62 (2), 275-282 (1986).
  22. Jacobberger, J. W., Horan, P. K., Hare, J. D. Analysis of malaria parasite-infected blood by flow cytometry. Cytometry:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 4 (3), 228-237 (1983).
  23. Bei, A. K., et al. A flow cytometry-based assay for measuring invasion of red blood cells by Plasmodium falciparum. American Journal of Hematology. 85 (4), 234 (2010).
  24. Montes, M., Jaensson, E. A., Orozco, A. F., Lewis, D. E., Corry, D. B. A general method for bead-enhanced quantitation by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 317 (1-2), 45-55 (2006).

Play Video

Citer Cet Article
de Lacerda, L., Castro, G., Gomes, C., Junqueira, C. In Vitro Assay of Plasmodium-Infected Red Blood Cell Killing by Cytotoxic Lymphocytes. J. Vis. Exp. (186), e63987, doi:10.3791/63987 (2022).

View Video