इन विट्रो साइटोटोक्सिक लिम्फोसाइटों द्वारा प्लास्मोडियम-संक्रमित लाल रक्त कोशिका की हत्या की परख
Summary
यहां हम संक्रमण के रक्त चरण के दौरान प्लास्मोडियम के लिए सेलुलर प्रतिरक्षा के तंत्र को स्पष्ट करने में मदद करने के लिए एक नई विधि का वर्णन करते हैं। यह एक इन विट्रो परख है जो साइटोटोक्सिक लिम्फोसाइटों द्वारा संक्रमित लाल रक्त कोशिका की हत्या को मापता है।
Abstract
मलेरिया एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य चिंता है, जो दुनिया भर में प्रति वर्ष 200 मिलियन से अधिक मामले पेश करता है। वैज्ञानिक प्रयासों के वर्षों के बावजूद, मलेरिया के लिए सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा अभी भी खराब समझी जाती है, मुख्य रूप से दीर्घकालिक प्लास्मोडियम संस्कृति की पद्धतिगत सीमाओं के कारण, विशेष रूप से प्लास्मोडियम विवैक्स के लिए। अधिकांश अध्ययनों ने एंटीबॉडी द्वारा मलेरिया के खिलाफ अनुकूली प्रतिरक्षा संरक्षण पर ध्यान केंद्रित किया है, जो मलेरिया को नियंत्रित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हालांकि, क्षीण प्लास्मोडियम स्पोरोज़ोइट्स टीकों द्वारा प्रेरित बाँझ सुरक्षा सेलुलर प्रतिक्रिया से संबंधित है, मुख्य रूप से साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइटों, जैसे सीडी 8 + और गामा डेल्टा टी कोशिकाओं (3 टी)। इसलिए, सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के कार्यों को बेहतर ढंग से समझने के लिए नई पद्धतियों को विकसित किया जाना चाहिए और इस प्रकार भविष्य की चिकित्सा और वैक्सीन विकास का समर्थन करना चाहिए। प्लाज्मोडियम रक्त-चरण संक्रमण के लिए इस सेल-मध्यस्थता प्रतिरक्षा का विश्लेषण करने के लिए एक नई रणनीति खोजने के लिए, हमारे समूह ने एक इन विट्रो परख की स्थापना की जो साइटोटोक्सिक लिम्फोसाइटों द्वारा संक्रमित लाल रक्त कोशिका (आईआरबीसी) की हत्या को मापता है। इस परख का उपयोग रक्त चरण में विभिन्न प्लास्मोडियम एसपीपी के खिलाफ सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया तंत्र का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। जन्मजात और अनुकूलनशील साइटोटोक्सिक प्रतिरक्षा कोशिकाएं सीधे एक प्रभावक: लक्ष्य तंत्र में आईआरबीसी और इंट्रासेल्युलर परजीवी को खत्म कर सकती हैं। लक्ष्य आईआरबीसी को सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए लेबल किया जाता है, और प्रभावक कोशिकाओं (सीडी 8 + टी, 3 टी, एनके कोशिकाओं, आदि) के साथ सह-संवर्धित किया जाता है। प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित परख में सहज लाइसिस नियंत्रण की तुलना में परीक्षण की गई स्थितियों के आधार पर लाइसिस प्रतिशत की गणना की जाती है। अंततः, यह हत्या परख पद्धति रक्त-चरण मलेरिया के लिए सेल-मध्यस्थता प्रतिरक्षा को समझने में एक प्रमुख प्रगति है, जिससे नए संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों को उजागर करने और मलेरिया टीकों के विकास में तेजी लाने में मदद मिलती है।
Introduction
मलेरिया एक वैश्विक स्वास्थ्य संकट बना हुआ है, जिसमें 2020 में 240 मिलियन से अधिक मामले और 627,000 मलेरिया से संबंधित मौतें दर्ज की गईहैं। वर्तमान में पांच परजीवी प्रजातियां हैं जो मनुष्यों में मलेरिया का कारण बन सकती हैं, जिनमें से प्लास्मोडियम फाल्सीपेरम और प्लास्मोडियम विवैक्स दो सबसे प्रचलित प्रजातियां हैं। प्लास्मोडियम संक्रमण के दौरान, यकृत या पूर्व-एरिथ्रोसाइटिक चरण स्पर्शोन्मुख होता है, और लक्षण केवल एरिथ्रोसाइटिक चरण में परजीवी के अलैंगिक चक्र के दौरान होते हैं। इस संक्रमण चरण में, यकृत चरण से प्राप्त हजारों मेरोज़ोइट्स रक्तप्रवाह में जारी किए जाते हैं और लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) को संक्रमित करते हैं। आरबीसी में, परजीवी स्किज़ोगोनी द्वारा ट्रोफोज़ोइट्स और स्किज़ोन्ट्स में अंतर करते हैं, जब तक कि स्किज़ोन्ट्स एरिथ्रोसाइट को तोड़ नहीं देते हैं, नवगठित मेरोज़ोइट्स जारी करते हैं, इस रक्त चक्र को दोहराते हैं। आक्रमण, प्रतिकृति और मेरोज़ोइट रिलीज के बार-बार चक्र के परिणामस्वरूप परजीवी आबादी की घातीय वृद्धि होती है और अंततः रोग के लक्षण 2 ट्रिगर होतेहैं।
मलेरिया के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का अध्ययन करने में एक महत्वपूर्ण चुनौती यह है कि प्लास्मोडियम एसपीपी। जो मनुष्यों को संक्रमित करता है वह प्रयोगशाला पशु मॉडल को संक्रमित नहीं करता है। इस प्रकार, प्लास्मोडियम संक्रमित रोगी के नमूने ताजा एकत्र किए जाने चाहिए और तुरंत संसाधित और विश्लेषण किए जाने चाहिए। हालांकि, मलेरिया-स्थानिक क्षेत्रों में, प्रतिरक्षात्मक और आणविक तंत्र तक पहुंचने के लिए संसाधन सीमित हैं। इन सीमाओं के कारण, कृन्तकों को व्यापक रूप से प्लाज्मोडियम संक्रमण के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की जांच के लिए प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है। जबकि पी. बर्गेई और पी. चाबौदी को अक्सर पी. फाल्सीपेरम संक्रमण के लिए सरोगेट के रूप में उपयोग किया जाता है, पी. योएली 17एक्सएनएल के गैर-घातक स्ट्रेन में भी पी. विवैक्स के साथ कई विशेषताएं हैं, जैसे कि रेटिकुलोसाइट प्रतिबंधित संक्रमण 3,4। प्लाज्मोडियम इन विट्रो परख का विकास, जिसका उपयोग मानव या पशु मॉडल-व्युत्पन्न नमूनों के लिए किया जा सकता है, मलेरिया के रोगजनन की बेहतर समझ प्राप्त करने और परजीवी की विभिन्न प्रजातियों द्वारा प्राप्त प्रतिरक्षात्मक प्रतिक्रिया की तुलना करने में मूल्यवान है।
सुरक्षात्मक एंटीमलेरियल प्रतिरक्षा को पूरी तरह से समझा नहीं जाता है या तो पूर्व-एरिथ्रोसाइटिक चरण और न ही रक्त चरण में। यह ज्ञात है कि बार-बार संक्रमण के संपर्क में आने से आंशिक अधिग्रहित प्रतिरक्षा होती है, लेकिन बाँझ प्रतिरक्षा शायद हीकभी विकसित होती है। दशकों से, एंटी-प्लास्मोडियम सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा मुख्य रूप से एंटीबॉडी को निष्क्रिय करने या ऑप्सिनाइजिंग करने के प्रेरण से जुड़ी थी जो मेजबान कोशिकाओं के परजीवी आक्रमण को रोकती है या एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाओं द्वारा फागोसाइटोसिस का कारण बनती है। नतीजतन, अब तक एंटीमलेरियल टीकों का उत्पादन करने के अधिकांश प्रयास सुरक्षात्मक और लंबे समय तक चलने वाले एंटीबॉडी 7,8 को प्रेरित करने पर निर्भर हैं। हालांकि, एक क्षीण स्पोरोज़ोइट के साथ टीकाकरण से प्रेरित बाँझ सुरक्षा सीधे साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइटों 8,9 के सक्रियण और विस्तार से संबंधित है।
हाल ही में, ताजा पृथक रोगी के नमूनों और इन विट्रो संस्कृतियों के कुछ अध्ययनों से पता चला है कि सीडी 8 + टी 10, 3 टी11, और एनके सेल12 जैसे जन्मजात या अनुकूलनशील साइटोटॉक्सिक प्रतिरक्षा कोशिकाएं प्लाज्मोडियम-संक्रमित आरबीसी और इसके इंट्रासेल्युलर परजीवी को सीधे प्रभावक: लक्ष्य अनुपात तरीके से खत्म कर सकती हैं। इन मौलिक निष्कर्षों ने मलेरिया के संदर्भ में एक पूरी तरह से नए प्रतिरक्षा प्रभावकारक तंत्र को परिभाषित किया। इस नई एंटीमलेरियल प्रतिरक्षा को विच्छेदित करने के लिए, प्राकृतिक संक्रमण या टीकाकरण में संक्रमित-आरबीसी (आईआरबीसी) के खिलाफ हत्यारे कोशिकाओं के साइटोटोक्सिक प्रभावकारक तंत्र का पता लगाना आवश्यक है।
यहां हम एक इन विट्रो परख प्रस्तुत करते हैं जो रक्त चरण में मलेरिया के खिलाफ लिम्फोसाइटों की साइटोटोक्सिक गतिविधि को मापता है। यह परख तब प्लास्मोडियम एरिथ्रोसाइट चरण के खिलाफ सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के तंत्र को स्पष्ट करने में मदद कर सकती है। लक्ष्य कोशिकाओं, आईआरबीसी को सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए कार्बोक्सीफ्लोरेसिन सक्सिनिमिडिल एस्टर (सीएफएसई) के साथ लेबल किया जाता है, और फिर साइटोटोक्सिक लिम्फोसाइटों (सीटीएल) जैसे प्रभावक कोशिकाओं के साथ सह-संवर्धित किया जाता है। इस कोकल्चर का मूल्यांकन फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किया जाता है, जिसमें विशिष्ट सेल प्रकारों के लिए फ्लोरोसेंट मार्करों का उपयोग किया जाता है। अंत में, सीटीएल द्वारा आईआरबीसी लाइसिस के प्रतिशत की गणना आरबीसी के सहज टूटने और सहज लाइसिस नियंत्रण द्वारा प्रयोगात्मक स्थिति को विभाजित करके की जाती है, जो प्रभावक सेल के दौरान इनक्यूबेशन बिना होता है। कुल मिलाकर, यह हत्या परख पद्धति सेल-मध्यस्थता मलेरिया प्रतिरक्षा की बेहतर समझ में योगदान कर सकती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम साइटोटोक्सिक लिम्फोसाइटों द्वारा प्लास्मोडियम संक्रमित लाल रक्त कोशिका की हत्या को मापने के लिए एक इन विट्रो परख का वर्णन करते हैं। यह परख मलेरिया परजीवी के एरिथ्रोसाइटिक चरण के लिए स?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम मलेरिया रोगी नामांकन और रक्त संग्रह के लिए डॉ धेलियो परेरा और रोंडोनिया के रिसर्च सेंटर फॉर ट्रॉपिकल मेडिसिन ऑफ रोंडोनिया (सीईपीईएम) के सदस्यों और पांडुलिपि संशोधन में मदद करने के लिए फेलिसिया हो को धन्यवाद देते हैं। निम्नलिखित अभिकर्मक बीईआई संसाधनों, एनआईएआईडी, एनआईएच के माध्यम से प्राप्त किया गया था: प्लास्मोडियम योइली सबएसपी योली, स्ट्रेन 17एक्सएनएल: पीवाईजीएफपी, एमआरए – 817, एना रोड्रिगेज द्वारा योगदान दिया गया। इस शोध को लेमन ब्राजील रिसर्च फंड, कॉन्सेलो नेशनल डी डेसेनवोल्विमेंटो साइंटिफिको ई टेक्नोलोजिको (सीएनपीक्यू) – 437851/2018-4, फैलोशिप (सीजे, जीसी, सीजी), और फंडाको डी एम्पारो डो एस्टाडो डी मिनास गेरैस (एफएपीईएमआईजी) – एपीक्यू -00653-16, एपीक्यू -02962-18 द्वारा समर्थित किया गया था; एपरफेइकोएटो डी पेस्सोअल डी निवेल सुपीरियर (सीएपीएस) – फैलोशिप (एलएल)।
Materials
| 100 μM cell strainer | Corning | 431752 | |
| 96 Well Round (U) Bottom Plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | |
| Anti-human CD235a (Glycophorin A) Antibody | Biolegend | 349114 | Used – APC anti-human CD235, dilution 1:100 |
| Anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317314 | Used – PB anti-human CD3, dilution 1:200 |
| Anti-human CD8 Antibody | Biolegend | 344714 | Used – APC/Cy7 anti-human CD8, dilution 1:200 |
| Anti-human TCR Vδ2 Antibody | Biolegend | 331408 | Used – PE anti-human TCR Vδ2, dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100733 | Used- PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a, dilution 1:200 |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody | Biolegend | 116223 | Used – APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119, dilution 1:200 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | Gibco | 26140079 | |
| Ficoll-Paque Plus | Cytiva | 17144003 | Lymphocyte Separation Medium (LSM) |
| Heparin Sodium Injection, USP | meithel pharma | 71228-400-003 | Used – 2000 USP units/2mL |
| Isoflurane | Piramal critical care | 66794-0013-25 | |
| LS MACS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSRFortessa Cell Analyzer | BD Bioscience | ||
| Percoll | Cytiva | 17089101 | Density Gradient Separation Medium (DGSM) |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | |
| Sodium bicarbonate, powder, BioReagent | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Syringe With Sub-Q needle – 1mL, 26 gauge; | BD | 14-829-10F | |
| Vacutainer Heparin Tube Glass Green 10 ml | BD | 366480 |
References
- WHO. Global Technical Strategy for Malaria 2016-2030, 2021 Update. World Health Organization. , (2021).
- Hafalla, J. C., Silvie, O., Matuschewski, K. Cell biology and immunology of malaria. Immunological Reviews. 240 (1), 297-316 (2011).
- Belnoue, E., et al. Vaccination with live Plasmodium yoelii blood stage parasites under chloroquine cover induces cross-stage immunity against malaria liver stage. Journal of Immunology. 181 (12), 8552-8558 (2008).
- Leong, Y. W., Lee, E. Q. H., Rénia, L., Malleret, B. Rodent malaria erythrocyte preference assessment by an ex vivo tropism assay. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 680136 (2021).
- Ladeia-Andrade, S., Ferreira, M. U., De Carvalho, M. E., Curado, I., Coura, J. R. Age-dependent acquisition of protective immunity to malaria in riverine populations of the amazon basin of Brazil. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 80 (3), 452-459 (2009).
- Antonelli, L. R., et al. The immunology of Plasmodium vivax malaria. Immunological Reviews. 293 (1), 163-189 (2020).
- Kazmin, D., et al. Systems analysis of protective immune responses to RTS, S malaria vaccination in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2425-2430 (2017).
- Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8+ T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
- Draper, S. J., et al. Malaria vaccines: recent advances and new horizons. Cell Host & Microbe. 24 (1), 43-56 (2018).
- Junqueira, C., et al. γδ T cells suppress Plasmodium falciparum blood-stage infection by direct killing and phagocytosis. Nature Immunology. 22 (3), 347-357 (2021).
- Junqueira, C., et al. Cytotoxic CD8+ T cells recognize and kill Plasmodium vivax-infected reticulocytes. Nature Medicine. 24 (9), 1330-1336 (2018).
- Arora, G., et al. NK cells inhibit Plasmodium falciparum growth in red blood cells via antibody-dependent cellular cytotoxicity. eLife. 7, 36806 (2018).
- Paul, F., Roath, S., Melville, D., Warhurst, D. C., Osisanya, J. O. S. Separation of malaria-infected erythrocytes from whole blood: use of a selective high-gradient magnetic separation technique. Lancet. 2 (8237), 70-71 (1981).
- Shaw-Saliba, K., et al. Insights into an optimization of Plasmodium vivax Sal-1 in vitro culture: the aotus primate model. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), 0004870 (2016).
- Mehlotra, R. K., et al. Long-term in vitro culture of Plasmodium vivax isolates from Madagascar maintained in Saimiri boliviensis blood. Malaria Journal. 16 (1), 442 (2017).
- Hojo-Souza, N. S., et al. Contributions of IFN-γ and granulysin to the clearance of Plasmodium yoelii blood stage. PLOS Pathogens. 16 (9), 1008840 (2020).
- Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J. C., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Current Protocols in Immunology. 84 (1), 4-9 (2009).
- Migliaccio, A. R. Erythroblast enucleation. Haematologica. 95 (12), 1985 (2010).
- Grimberg, B. T., Erickson, J. J., Sramkoski, R. M., Jacobberger, J. W., Zimmerman, P. A. Monitoring Plasmodium falciparum growth and development by UV flow cytometry using an optimized Hoechst-thiazole orange staining strategy. Cytometry Part A:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 73 (6), 546-554 (2008).
- Pattanapanyasat, K., et al. Culture of malaria parasites in two different red blood cell populations using biotin and flow cytometry. Cytometry:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 25 (3), 287-294 (1996).
- Bianco, A. E., Battye, F. L., Brown, G. V. Plasmodium falciparum: rapid quantification of parasitemia in fixed malaria cultures by flow cytometry. Experimental Parasitology. 62 (2), 275-282 (1986).
- Jacobberger, J. W., Horan, P. K., Hare, J. D. Analysis of malaria parasite-infected blood by flow cytometry. Cytometry:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 4 (3), 228-237 (1983).
- Bei, A. K., et al. A flow cytometry-based assay for measuring invasion of red blood cells by Plasmodium falciparum. American Journal of Hematology. 85 (4), 234 (2010).
- Montes, M., Jaensson, E. A., Orozco, A. F., Lewis, D. E., Corry, D. B. A general method for bead-enhanced quantitation by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 317 (1-2), 45-55 (2006).
