インビトロ 細胞傷害性リンパ球による マラリア原虫感染赤血球殺傷のアッセイ
Summary
ここでは、感染の血液期における マラリア原虫 に対する細胞性免疫のメカニズムを解明するのに役立つ新しい方法について説明します。これは、細胞傷害性リンパ球による感染した赤血球の死滅を測定する in vitro アッセイです。
Abstract
マラリアは公衆衛生上の大きな懸念事項であり、世界中で年間2億件以上の症例が発生しています。長年の科学的努力にもかかわらず、マラリアに対する防御免疫は、主に長期マラリア原虫培養、特に三日熱マラリア原虫の方法論的限界のために、まだよく理解されていません。ほとんどの研究は、マラリアの制御に重要な役割を果たす抗体によるマラリアに対する適応免疫防御に焦点を当てています。しかし、弱毒化マラリア原虫スポロゾイトワクチンによって誘導される無菌防御は、主にCD8+やガンマデルタT細胞(γδT)などの細胞傷害性Tリンパ球に対する細胞応答に関連しています。したがって、細胞性免疫応答の機能をよりよく理解し、将来の治療法とワクチン開発をサポートするために、新しい方法論を開発する必要があります。マラリア原虫の血液期感染に対するこの細胞性免疫を解析する新しい戦略を見つけるために、私たちのグループは、細胞傷害性リンパ球による感染赤血球(iRBC)の死滅を測定するin vitroアッセイを確立しました。このアッセイは、血液期のさまざまなマラリア原虫属に対する細胞性免疫応答メカニズムの研究に使用できます。自然免疫細胞および適応性細胞傷害性免疫細胞は、エフェクター:標的機構においてi赤血球および細胞内寄生虫を直接排除することができる。標的iRBCを標識して細胞生存率を評価し、エフェクター細胞(CD8+ T、γδ T、NK細胞など)と共培養します。溶解率は、フローサイトメトリーベースのアッセイにおける自然溶解制御と比較して、試験条件に基づいて計算されます。最終的に、この殺傷アッセイ法は、血液ステージマラリアに対する細胞性免疫の理解における大きな進歩であり、新しい潜在的な治療標的の発見とマラリアワクチンの開発の加速に役立ちます。
Introduction
マラリアは依然として世界的な健康危機であり、2020年には2億4,000万人以上の症例と627,000人のマラリア関連の死亡が報告されています1。現在、ヒトにマラリアを引き起こす可能性のある5つの寄生種があり、そのうち熱帯熱マラリア原虫と三日熱マラリア原虫が2つの最も一般的な種です。 マラリア原虫感染中、肝臓または前赤血球期は無症候性であり、症状は赤血球期の寄生虫の無性周期中にのみ発生します。この感染段階では、肝臓段階に由来する何千ものメロゾイトが血流に放出され、赤血球(RBC)に感染します。RBCでは、寄生虫は統合失調症によって栄養生物と分裂虫に分化し、分裂病が赤血球を破裂させ、新たに形成されたメロゾイトを放出し、この血流を繰り返します。侵入、複製、メロゾイト放出のサイクルが繰り返されると、寄生虫集団が指数関数的に増加し、最終的に病気の症状を引き起こします2。
マラリアに対する免疫応答を研究する上で重要な課題は、マラリア原虫属です。 ヒトに感染することは実験動物モデルには感染しない。したがって、マラリア原虫に感染した患者のサンプルは新鮮に収集し、直ちに処理および分析する必要があります。しかし、マラリア流行地域では、免疫学的および分子的メカニズムにアクセスするためのリソースは限られています。これらの制限により、げっ歯類は、マラリア原虫感染に対する免疫応答を調査するための実験モデルとして広く使用されています。P. bergheiとP. chabaudiは熱帯熱マラリア原虫感染の代用としてよく使用されますが、P. yoelii 17XNLの非致死性株は、網状赤血球制限感染など、三日熱マラリア原虫と共通する多くの特徴も持っています3,4。ヒトまたは動物モデル由来のサンプルに使用できるマラリア原虫in vitroアッセイの開発は、マラリアの病因をよりよく理解し、異なる種の寄生虫によって誘発される免疫学的応答を比較する上で価値があります。
抗マラリア防御免疫は、前赤血球期でも血液期でも完全には理解されていません。反復感染への曝露は部分的な獲得免疫をもたらすことが知られていますが、無菌免疫はほとんど発達しません5。何十年もの間、抗マラリア原虫防御免疫は主に、宿主細胞への寄生虫侵入を防ぐ、または抗原提示細胞による食作用を引き起こす中和抗体またはオプソニン化抗体の誘導にそれぞれ関連していました6。その結果、これまでの抗マラリアワクチン製造のほとんどの努力は、防御的で長持ちする抗体の誘導に依存してきました7,8。しかし、弱毒化スポロゾイトによるワクチン接種によって誘導される無菌防御は、細胞傷害性Tリンパ球の活性化および増殖と直接相関する8,9。
最近、新たに単離された患者サンプルおよび in vitro 培養に関するいくつかの研究は、CD8+ T10、γδ T11、およびNK細胞12のような自然または適応性の細胞傷害性免疫細胞が、 マラリア原虫に感染したRBCおよびその細胞内寄生虫をエフェクター:ターゲット比で直接排除できることを実証した。これらの独創的な発見は、マラリアの文脈における全く新しい免疫エフェクターメカニズムを定義しました。この新しい抗マラリア免疫を解剖するためには、自然感染やワクチン接種における感染赤血球(iRBC)に対するキラー細胞の細胞傷害性エフェクター機構を探索することが不可欠です。
ここでは、血液ステージのマラリアに対するリンパ球の細胞傷害活性を測定する in vitro アッセイを紹介します。このアッセイは、 マラリア原虫 赤血球期に対する細胞性免疫応答のメカニズムを解明するのに役立ちます。標的細胞であるiRBCをカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)で標識して細胞生存率を評価した後、細胞傷害性リンパ球(CTL)などのエフェクター細胞と共培養します。次に、この共培養をフローサイトメトリーで評価し、特定の細胞タイプの蛍光マーカーを使用します。最後に、CTLによるiRBC溶解の割合は、実験条件をRBCの自然破裂と、エフェクター細胞なしのインキュベーション中に発生する自然溶解制御で割ることによって計算されます。全体として、この殺傷アッセイ法は、細胞媒介性マラリア免疫のより良い理解に貢献することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、細胞傷害性リンパ球によるマラリア原虫感染赤血球死を測定するためのin vitroアッセイについて説明します。このアッセイは、マラリア原虫の赤血球期に対する細胞防御免疫のメカニズムを解明するのに役立ちます。この方法論の主な利点は、免疫細胞がさまざまなマラリア原虫属菌とどのように相互作用するかに関する多くの質問に対処するために使用でき?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dhelio Pereira博士とロンドニア熱帯医学研究センター(CEPEM)のマラリア患者の登録と採血、および原稿の改訂を支援してくれたFelicia Hoに感謝します。以下の試薬は、BEI Resources, NIAID, NIH: Plasmodium yoelii subsp. yoelii, Strain 17XNL:PyGFP, MRA- 817, Ana Rodriguezによって提供された。この研究は、Lemann Brazil Research Fund、Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) – 437851/2018-4、フェローシップ(CJ、GC、CG)、およびFundação de Amparo do Estado de Minas Gerais(FAPEMIG)-APQ-00653-16、APQ-02962-18の支援を受けました。Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Fellowship (LL).
Materials
| 100 μM cell strainer | Corning | 431752 | |
| 96 Well Round (U) Bottom Plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | |
| Anti-human CD235a (Glycophorin A) Antibody | Biolegend | 349114 | Used – APC anti-human CD235, dilution 1:100 |
| Anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317314 | Used – PB anti-human CD3, dilution 1:200 |
| Anti-human CD8 Antibody | Biolegend | 344714 | Used – APC/Cy7 anti-human CD8, dilution 1:200 |
| Anti-human TCR Vδ2 Antibody | Biolegend | 331408 | Used – PE anti-human TCR Vδ2, dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100733 | Used- PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a, dilution 1:200 |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody | Biolegend | 116223 | Used – APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119, dilution 1:200 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | Gibco | 26140079 | |
| Ficoll-Paque Plus | Cytiva | 17144003 | Lymphocyte Separation Medium (LSM) |
| Heparin Sodium Injection, USP | meithel pharma | 71228-400-003 | Used – 2000 USP units/2mL |
| Isoflurane | Piramal critical care | 66794-0013-25 | |
| LS MACS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSRFortessa Cell Analyzer | BD Bioscience | ||
| Percoll | Cytiva | 17089101 | Density Gradient Separation Medium (DGSM) |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | |
| Sodium bicarbonate, powder, BioReagent | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Syringe With Sub-Q needle – 1mL, 26 gauge; | BD | 14-829-10F | |
| Vacutainer Heparin Tube Glass Green 10 ml | BD | 366480 |
References
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