체외 세포독성 림프구에 의한 변형체 감염 적혈구 사멸 분석
Summary
여기서 우리는 감염의 혈액 단계에서 Plasmodium 에 대한 세포 면역의 메커니즘을 밝히는 데 도움이되는 새로운 방법을 설명합니다. 이것은 세포 독성 림프구에 의한 감염된 적혈구 사멸을 측정하는 시험관 내 분석입니다.
Abstract
말라리아는 전 세계적으로 연간 2억 건 이상의 사례가 발생하는 주요 공중 보건 문제입니다. 수년간의 과학적 노력에도 불구하고 말라리아에 대한 보호 면역은 주로 장기 Plasmodium 배양의 방법론적 한계, 특히 Plasmodium vivax의 한계 로 인해 여전히 잘 이해되지 않고 있습니다. 대부분의 연구는 말라리아 통제에 중요한 역할을 하는 항체에 의한 말라리아에 대한 적응 면역 보호에 초점을 맞추었습니다. 그러나 약독화 Plasmodium sporozoites 백신에 의해 유도된 멸균 보호는 주로 CD8+ 및 감마 델타 T 세포(γδ T)와 같은 세포독성 T 림프구에 대한 세포 반응과 관련이 있습니다. 따라서 세포 면역 반응의 기능을 더 잘 이해하고 향후 치료법 및 백신 개발을 지원하기 위한 새로운 방법론을 개발해야 합니다. Plasmodium 혈액 단계 감염에 대한 이 세포 매개 면역을 분석하기 위한 새로운 전략을 찾기 위해 우리 그룹은 세포독성 림프구에 의한 감염된 적혈구(iRBC) 사멸을 측정하는 시험관 내 분석을 확립했습니다. 이 분석은 혈액 단계에서 다른 Plasmodium spp.에 대한 세포 면역 반응 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 선천성 및 적응성 세포독성 면역 세포는 이펙터:표적 메커니즘에서 iRBC와 세포내 기생충을 직접 제거할 수 있습니다. 표적 iRBC를 표지하여 세포 생존율을 평가하고 이펙터 세포(CD8+ T, γδ T, NK 세포 등)와 공동 배양합니다. 용해 백분율은 유세포 분석 기반 분석에서 자발적인 용해 제어와 비교하여 테스트된 조건을 기반으로 계산됩니다. 궁극적으로, 이 사멸 분석 방법론은 혈액 단계 말라리아에 대한 세포 매개 면역을 이해하는 데 있어 중요한 발전이며, 새로운 잠재적 치료 표적을 발견하고 말라리아 백신 개발을 가속화하는 데 도움이 됩니다.
Introduction
말라리아는 2020년에 2억 4천만 건 이상의 사례와 627,000명의 말라리아 관련 사망자가 보고된 글로벌 보건 위기로 남아 있습니다1. 현재 인간에게 말라리아를 일으킬 수 있는 5종의 기생충이 있으며, 그 중 Plasmodium falciparum 과 Plasmodium vivax 가 가장 널리 퍼진 두 종입니다. Plasmodium 감염 동안 간 또는 적혈구 전 단계는 무증상이며 증상은 적혈구 단계에서 기생충의 무성 주기 동안에만 발생합니다. 이 감염 단계에서 간 단계에서 파생된 수천 개의 메로조이트가 혈류로 방출되어 적혈구(RBC)를 감염시킵니다. RBC에서 기생충은 분열증에 의해 영양체와 분열체로 분화되며, 분열증이 적혈구를 파열시켜 새로 형성된 메로조이트를 방출하여 이 혈액 주기를 반복합니다. 침입, 복제, 메로조이트 방출의 반복적인 주기는 기생충 개체수의 기하급수적인 증가를 초래하고 궁극적으로 질병 증상을 유발한다2.
말라리아에 대한 면역 반응을 연구하는 데 있어 중요한 과제는 Plasmodium spp. 인간을 감염시키는 것은 실험실 동물 모델을 감염시키지 않습니다. 따라서 Plasmodium에 감염된 환자 샘플을 신선하게 수집하고 즉시 처리 및 분석해야 합니다. 그러나 말라리아 발병 지역에서는 면역학적 및 분자적 메커니즘에 접근할 수 있는 자원이 제한적입니다. 이러한 한계로 인해 설치류는 변형체 감염에 대한 면역 반응을 조사하기 위한 실험 모델로 널리 사용됩니다. P. berghei와 P. chabaudi는 종종 P. falciparum 감염의 대리모로 사용되지만, P. yoelii 17XNL의 치명적이지 않은 균주는 망상 적혈구 제한 감염과 같은 P. vivax와 공통점이 많다 3,4. 인간 또는 동물 모델 유래 샘플에 사용할 수 있는 Plasmodium in vitro 분석의 개발은 말라리아의 발병기전을 더 잘 이해하고 다른 종의 기생충에 의해 유도된 면역학적 반응을 비교하는 데 중요합니다.
보호 항 말라리아 면역은 적혈구 전 단계나 혈액 단계에서 완전히 이해되지 않습니다. 반복적인 감염에 노출되면 부분적인 후천성 면역이 발생하는 것으로 알려져 있으나 무균 면역은 거의 발달하지 않는다5. 수십 년 동안, 항변형체 보호 면역은 주로 숙주 세포의 기생충 침입을 막거나 항원 제시 세포에 의한 식균 작용을 유발하는 중화 또는 옵소닌화 항체의 유도와 관련이 있었다6. 그 결과, 지금까지 항말라리아 백신을 생산하기 위한 대부분의 노력은 보호적이고 오래 지속되는 항체를 유도하는 데 의존해 왔다 7,8. 그러나, 약독화된 포자소체에 의한 백신 접종에 의해 유도된 무균 보호는 세포독성 T 림프구의 활성화 및 확장과 직접적으로 상관관계가 있다 8,9.
최근에, 갓 분리된 환자 샘플 및 시험관 내 배양에 대한 일부 연구에서는 CD8+ T10, γδ T 11 및 NK 세포12와 같은 선천적 또는 적응성 세포독성 면역 세포가 이펙터:표적 비율 방식으로 변형체에 감염된 적혈구 및 그 세포내 기생충을 직접 제거할 수 있음을 입증했습니다. 이러한 중요한 발견은 말라리아의 맥락에서 완전히 새로운 면역 이펙터 메커니즘을 정의했습니다. 이 새로운 항말라리아 면역을 해부하기 위해서는 자연 감염 또는 백신 접종에서 감염된 적혈구(iRBC)에 대한 킬러 세포의 세포독성 이펙터 메커니즘을 탐색하는 것이 필수적입니다.
여기에서 우리는 혈액 단계에서 말라리아에 대한 림프구의 세포 독성 활성을 측정하는 시험관 내 분석을 제시합니다. 이 분석은 Plasmodium 적혈구 단계에 대한 세포 면역 반응의 메커니즘을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 표적 세포인 iRBC는 세포 생존율을 평가하기 위해 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(CFSE)로 표지된 다음 세포독성 림프구(CTL)와 같은 이펙터 세포와 함께 배양됩니다. 그런 다음 이 공동 배양은 특정 세포 유형에 대한 형광 마커를 사용하여 유세포 분석으로 평가됩니다. 마지막으로, CTL에 의한 iRBC 용해의 백분율은 실험 조건을 RBC의 자발적 파열과 이펙터 세포 없이 배양하는 동안 발생하는 자발적 용해 조절로 나누어 계산합니다. 전반적으로, 이 사멸 분석 방법론은 세포 매개 말라리아 면역에 대한 더 나은 이해에 기여할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서는 세포독성 림프구에 의한 변형체 감염 적혈구 사멸을 측정하기 위한 시험관 내 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 말라리아 기생충의 적혈구 단계에 대한 세포 보호 면역 메커니즘을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법론의 주요 장점은 면역 세포가 다른 Plasmodium spp.와 상호 작용하는 방법에 대한 많은 질문을 해결하는 데 사용할 수 있는 iRBC의 세포 매개 사?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
말라리아 환자 등록 및 채혈을 위해 Dhelio Pereira 박사와 Rondônia 열대 의학 연구 센터 (CEPEM) 회원들과 원고 수정을 도와 주신 Felicia Ho에게 감사드립니다. 다음 시약은 BEI Resources, NIAID, NIH를 통해 입수하였다: Plasmodium yoelii subsp. yoelii, Strain 17XNL:PyGFP, MRA-817, Ana Rodriguez에 의해 기여됨. 이 연구는 Lemann Brazil Research Fund, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico(CNPq) – 437851/2018-4, 펠로우십(CJ, GC, CG) 및 Fundação de Amparo do Estado de Minas Gerais(FAPEMIG) – APQ-00653-16, APQ-02962-18; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – 친교 (LL).
Materials
| 100 μM cell strainer | Corning | 431752 | |
| 96 Well Round (U) Bottom Plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | |
| Anti-human CD235a (Glycophorin A) Antibody | Biolegend | 349114 | Used – APC anti-human CD235, dilution 1:100 |
| Anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317314 | Used – PB anti-human CD3, dilution 1:200 |
| Anti-human CD8 Antibody | Biolegend | 344714 | Used – APC/Cy7 anti-human CD8, dilution 1:200 |
| Anti-human TCR Vδ2 Antibody | Biolegend | 331408 | Used – PE anti-human TCR Vδ2, dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100733 | Used- PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a, dilution 1:200 |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody | Biolegend | 116223 | Used – APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119, dilution 1:200 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | Gibco | 26140079 | |
| Ficoll-Paque Plus | Cytiva | 17144003 | Lymphocyte Separation Medium (LSM) |
| Heparin Sodium Injection, USP | meithel pharma | 71228-400-003 | Used – 2000 USP units/2mL |
| Isoflurane | Piramal critical care | 66794-0013-25 | |
| LS MACS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSRFortessa Cell Analyzer | BD Bioscience | ||
| Percoll | Cytiva | 17089101 | Density Gradient Separation Medium (DGSM) |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | |
| Sodium bicarbonate, powder, BioReagent | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Syringe With Sub-Q needle – 1mL, 26 gauge; | BD | 14-829-10F | |
| Vacutainer Heparin Tube Glass Green 10 ml | BD | 366480 |
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