Cerebrale organoïde cultuur vergemakkelijken via laterale zachte lichtverlichting
Summary
Cerebrale organoïden bieden ongekende mogelijkheden voor het bestuderen van orgaanontwikkeling en menselijke ziektepathologie. Hoewel er veel succes is geboekt met cerebrale organoïde kweeksystemen, zijn er nog steeds operationele problemen bij het toepassen van deze technologie. Het huidige protocol beschrijft een cerebrale organoïde procedure die mediumverandering en organoïde overdracht vergemakkelijkt.
Abstract
Op dit moment is cerebrale organoïde cultuurtechnologie nog steeds ingewikkeld om te bedienen en moeilijk op grote schaal toe te passen. Het is noodzakelijk om een eenvoudige en praktische oplossing te vinden. Daarom wordt in deze studie een meer haalbaar cerebraal organoïde protocol voorgesteld. Om het onvermijdelijke ongemak bij mediumverandering en organoïde transfer in een vroeg stadium op te lossen, optimaliseert het huidige onderzoek de bedieningstechnologie door het engineeringprincipe toe te passen. Een zachte lichtlamp werd gebruikt om de embryoïde lichaamsmonsters (EB) zijdelings te verlichten, waardoor de EB’s met het blote oog kunnen worden gezien door het verbeterde diffuse reflectie-effect. Met behulp van het principe van secundaire stroom gegenereerd door rotatie, verzamelen de organoïden zich naar het midden van de put, wat de werking van mediumverandering of organoïde overdracht vergemakkelijkt. In vergelijking met de gedispergeerde cel nestelt het embryoïde lichaam zich sneller in de pipet. Met behulp van dit fenomeen kunnen de meeste vrije cellen en dode celfragmenten op een eenvoudige manier effectief worden verwijderd, waardoor WORDT voorkomen dat EB’s schade oplopen door centrifugatie. Deze studie vergemakkelijkt de werking van cerebrale organoïde cultuur en helpt de toepassing van hersenorganoïden te bevorderen.
Introduction
In vergelijking met tweedimensionale (2D) cultuursystemen hebben driedimensionale (3D) cultuursystemen verschillende voordelen, waaronder echte replicatie en efficiënte reproductie van complexe structuren van bepaalde organen1. Daarom zijn cerebrale organoïden een van de belangrijke hulpmethoden voor de onderzoeksgebieden van de ontwikkeling van het menselijk brein en ziekte2, geneesmiddelenscreening en celtherapie.
Het kweken van cerebrale organoïden door middel van de roterende suspensiemethode is bevorderlijk voor hun ontwikkeling en rijping3. Hoewel cerebrale organoïde kweeksystemen veel succes hebben geboekt, worden ze nog steeds geconfronteerd met kritieke uitdagingen die hun toepassing beperken. Handmatige teelt omvat bijvoorbeeld gecompliceerde manipulatiestappen en introduceert obstakels voor het bereiken van grootschalige toepassingen. Bovendien zijn in elk ontwikkelingsstadium in de cultuur van cerebrale organoïden veranderingen in verschillende media en cytokines nodig4. In het vroege stadium hebben de organoïden of EB’s echter kleine afmetingen (ongeveer 200 μm tot 300 μm) en zijn ze bijna visueel ontoegankelijk zonder geschikte apparatuur. Onvermijdelijk wordt een bepaalde hoeveelheid kostbare organoïde monsters weggespoeld wanneer het medium wordt vervangen. Er zijn veel technieken onderzocht om dit in andere soorten organoïde culturen te overwinnen, en enkele voorbeelden zijn het onderdompelen van hele organoïde chips in een kweekmedium gedurende 3 dagen zonder interventie5; het toevoegen van een vers medium door de coverslip nadat het oude medium is geabsorbeerd met absorberend papier5; of het toepassen van complexe microfluïdische pijpleidingen voor vloeistofuitwisseling 6,7,8. Een ander obstakel dat in het vroege stadium van organoïdeteelt wordt ondervonden, is de moeilijkheid om directe waarnemingen met het blote oog te bereiken, wat slechte operaties kan veroorzaken die leiden tot organoïde schade en verlies tijdens de organoïde overdrachtsstappen. Daarom is het noodzakelijk om een haalbaarder protocol op te stellen dat mediumverandering en organoïde-overdracht vergemakkelijkt om organoïden te genereren.
Een overeenkomstige geoptimaliseerde werking op basis van technische principes wordt voorgesteld om deze problemen te overwinnen, wat veel organoïde procedures aanzienlijk en gemakkelijk vergemakkelijkt. In de natuur, wanneer de zon door een raamopening in een huis schijnt, kan het blote oog het stof zien dansen in de lichtstraal. Door de diffuse reflectie van zonlicht op stof wordt wat licht in de oogbol gebroken om een visueel beeld te produceren. Geïnspireerd door het principe van dit fenomeen 9,10, maakte deze studie een zachtlichtlamp en verlichtte de EB’s zijdelings. Het bleek dat EV’s visueel duidelijk konden zijn zonder de kijkkijker te beïnvloeden. Een secundaire stroom die naar het midden wijst, wordt in de vloeistof gegenereerd door de kweekplaat te roteren als gevolg van wervelstromen11. Oorspronkelijk verspreide EV’s hopen zich op in het midden van de plaat. Op basis hiervan, en het fenomeen dat de sedimentatiesnelheid van organoïden sneller is dan die van cellen, wordt een eenvoudige werkwijze van mediumverandering en organoïde-overdracht zonder centrifugatie voorgesteld. De organoïden in het kweekmedium kunnen door deze overdrachtsoperatie effectief worden gescheiden van vrije cellen en dode celfragmenten.
Hier wordt een protocol voorgesteld dat gemakkelijk te bedienen is om cerebrale organoïden te genereren uit menselijke pluripotente stamcellen. De bedieningstechnologie werd geoptimaliseerd door het engineeringprincipe toe te passen, waardoor bewerkingen in 3D-cultuur net zo eenvoudig en haalbaar werden als die in de 2D-cultuur. De verbeterde vloeistofuitwisselingsmethode en organoïde-overdrachtsoperatie zijn ook nuttig voor andere soorten organoïde cultuur en het ontwerp van automatische kweekmachines.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cerebrale organoïden openen nieuwe wegen voor medisch onderzoek. Veel nuttige toepassingen van deze technologie beginnen pas te worden onderzocht28. Uit dit onderzoek bleek dat de transcriptoomsequencingresultaten van genetisch zieke cerebrale organoïden en normale cerebrale organoïden de verschillen tussen ziekte en gezondheid kunnen weerspiegelen. De resultaten van de RNA-seq-gegevensanalyse (figuur 3B) zijn bijvoorbeeld consistent met veel gerapporteerde studies…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de Natural Science Foundation van de provincie Guangdong (Grant No. 2020A0505100062), het Guangzhou City Science and Technology Key Topics Project (Grant No. 201904020025), de National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 31872800, 32070582, 82101937) en het Guangzhou City Postdoctoral Research Grant-project (aan Bangzhu Chen).
Materials
| 0.2 μm Filter | NEST Biotechnology, China | 331001 | |
| 1000 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405163 | |
| 200 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck, Germany | 8057400005 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio, China | G1101 | |
| 6-well low adhesion plate | NEST Biotechnology, China | 703011 | It is used for EBs suspension cultures |
| Aaccute cell detachment solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07920 | It is used to digest iPSC into single cells. |
| AggreWell800 24-well | STEMCELL Technologies, Canada | 34811 | Microporous culture plate for EBs preparation. |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07010 | Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion |
| B27-vit. A supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 12587010 | |
| bFGF | Peprotech, USA | GMP100-18B | |
| BSA | Beyotime Biotechnology, China | ST025 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5810 R | It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates. |
| Cover glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 10212020C | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology, China | C1002 | Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11330032 | |
| ES-quality FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 10270106 | |
| Ficoll Paque | General Electric Company, USA | 17-5442-02 | Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method. |
| Gelatin | Sangon Bioteach, China | A609764 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 35050061 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17504044 | |
| Goat anti-Chicken IgY secondary antibody | Abcam, UK | ab150171 | Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Mouse IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150120 | Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150077 | Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Heparin | Merck, Germany | H3149 | |
| Horizontal shaker | Servicebio, China | DS-H200 | Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland). |
| Insulin | Merck, Germany | I9278-5ML | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific, USA | 10828028 | |
| Matrigel | Corning, USA | 354277 | Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature. |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, USA | 11140050 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies, Canada | 85850 | iPSC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17502048 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, USA | 21103049 | |
| OCT4 primary antibody | Abcam, UK | ab19857 | Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution. |
| Pathological frozen slicer | Leica, Germany | Leica CM1860 | |
| PAX6 primary antibody | Abcam, UK | ab78545 | Host: Mouse. Use at 1:100 dilution. |
| PBS | STEMCELL Technologies, Canada | 37350 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, USA | 15140122 | |
| PSC dissociation solution | Beijing Saibei Biotechnology, China | CA3001500 | Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage. |
| Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific, USA | A16518 | Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit. |
| Slide Glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 188105W | |
| Soft light lamp | NUT | NUT | A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8570 | Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8571 | Maturation Medium |
| Sucrose | Sangon Bioteach, China | A502792 | |
| Triton X-100 | Merck, Germany | X100 | |
| TUJ1 primary antibody | Abcam, UK | ab41489 | Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution. |
| Vaseline | Sangon Bioteach, China | A510146 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies, Canada | 72302 | Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS. |
| Weblink | |||
| Raw sequencing data | Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences | GSA-Human: HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
References
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (33), (2020).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. et al.Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Hu, Y., et al. Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week. Nature Communications. 12 (1), 2581 (2021).
- Jung, D. J., et al. A one-stop microfluidic-based lung cancer organoid culture platform for testing drug sensitivity. Lab on a Chip. 19 (17), 2854-2865 (2019).
- Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).
- Gkatzis, K., Taghizadeh, S., Huh, D., Stainier, D. Use of three-dimensional organoids and lung-on-a-chip methods to study lung development, regeneration and disease. The European Respiratory Journal. 52 (5), 1800876 (2018).
- Ye, Y., Pui, D. Detection of nanoparticles suspended in a light scattering medium. Scientific Reports. 11 (1), 20268 (2021).
- Staven, V., Waaseth, M., Wang, S., Grønlie, I., Tho, I. Utilization of the tyndall effect for enhanced visual detection of particles in compatibility testing of intravenous fluids: Validity and reliability. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 69 (2), 270-283 (2015).
- Fukuma, Y., Inui, T., Imashiro, C., Kurashina, Y., Takemura, K. Homogenization of initial cell distribution by secondary flow of medium improves cell culture efficiency. PloS One. 15 (7), 0235827 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Ouyang, S., et al. CRISPR/Cas9-targeted deletion of polyglutamine in spinocerebellar ataxia type 3-derived induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 27 (11), 756-770 (2018).
- Xian, Y., et al. The safety and effectiveness of genetically corrected iPSCs derived from β-thalassaemia patients in nonmyeloablative β-thalassaemic mice. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 288 (2020).
- Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Knight, G. T., et al. Engineering induction of singular neural rosette emergence within hPSC-derived tissues. eLife. 7, 37549 (2018).
- Rieder, H. L., Smithwick, R. W. RPM or RCF. The American Review of Respiratory Disease. 132 (6), 1371 (1985).
- Dole, V. P., Cotzias, G. C. A nomogram for the calculation of relative centrifugal force. Science. 113 (2941), 552-553 (1951).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Kathuria, A., et al. Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
- Paşca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Tang, X. Y., et al. DSCAM/PAK1 pathway suppression reverses neurogenesis deficits in iPSC-derived cerebral organoids from patients with Down syndrome. The Journal of Clinical Investigation. 131 (12), 135763 (2021).
- Costa, M., Paulson, H. L. Toward understanding Machado-Joseph disease. Progress in Neurobiology. 97 (2), 239-257 (2012).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature Biotechnology. 28 (5), 511-515 (2010).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Klockgether, T., et al. Age related axonal neuropathy in spinocerebellar ataxia type 3/Machado-Joseph disease (SCA3/MJD). Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 66 (2), 222-224 (1999).
- Khan, L. A., et al. Expanded polyglutamines impair synaptic transmission and ubiquitin-proteasome system in Caenorhabditis elegans. Journal of Neurochemistry. 98 (2), 576-587 (2006).
- Teixeira-Castro, A., et al. Serotonergic signalling suppresses ataxin 3 aggregation and neurotoxicity in animal models of Machado-Joseph disease. Brain: A Journal of Neurology. 138, 3221-3237 (2015).
- Joers, J. M., et al. Neurochemical abnormalities in premanifest and early spinocerebellar ataxias. Annals of Neurology. 83 (4), 816-829 (2018).
- Sivitilli, A., Ghiasi, P., Attisano, L. Production of phenotypically uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Bio-protocol. 11 (8), 3985 (2021).
- Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
- Camp, J. G., Treutlein, B. Human development: Advances in mini-brain technology. Nature. 545 (7652), 39-40 (2017).
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).
- Yoon, S. J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
