पार्श्व नरम प्रकाश रोशनी के माध्यम से सेरेब्रल ऑर्गेनोइड संस्कृति की सुविधा
Summary
सेरेब्रल ऑर्गेनोइड अंग विकास और मानव रोग विकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए अभूतपूर्व अवसर प्रदान करते हैं। यद्यपि सेरेब्रल ऑर्गेनोइड संस्कृति प्रणालियों के साथ बड़ी सफलता हासिल की गई है, फिर भी इस तकनीक को लागू करने में परिचालन कठिनाइयां हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल एक सेरेब्रल ऑर्गेनोइड प्रक्रिया का वर्णन करता है जो मध्यम परिवर्तन और ऑर्गेनोइड स्थानांतरण की सुविधा प्रदान करता है।
Abstract
वर्तमान में, सेरेब्रल ऑर्गेनोइड संस्कृति प्रौद्योगिकी अभी भी संचालित करने के लिए जटिल है और बड़े पैमाने पर लागू करना मुश्किल है। एक सरल और व्यावहारिक समाधान खोजना आवश्यक है। इसलिए, वर्तमान अध्ययन में एक अधिक व्यवहार्य सेरेब्रल ऑर्गेनोइड प्रोटोकॉल प्रस्तावित है। प्रारंभिक अवस्था में मध्यम परिवर्तन और ऑर्गेनोइड हस्तांतरण में अपरिहार्य असुविधा को हल करने के लिए, वर्तमान शोध इंजीनियरिंग सिद्धांत को लागू करके ऑपरेशन तकनीक का अनुकूलन करता है। भ्रूण शरीर (ईबी) नमूनों को पार्श्व रूप से रोशन करने के लिए एक नरम प्रकाश दीपक को अपनाया गया था, जिससे ईबी को बढ़ाया फैलाना प्रतिबिंब प्रभाव के माध्यम से नग्न आंखों से देखा जा सकता है। रोटेशन द्वारा उत्पन्न माध्यमिक प्रवाह के सिद्धांत का उपयोग करते हुए, ऑर्गेनोइड कुएं के केंद्र की ओर इकट्ठा होते हैं, जो मध्यम परिवर्तन या ऑर्गेनोइड हस्तांतरण के संचालन की सुविधा प्रदान करता है। छितरी हुई कोशिका की तुलना में, भ्रूण शरीर पिपेट में तेजी से बसता है। इस घटना का उपयोग करके, अधिकांश मुक्त कोशिकाओं और मृत कोशिका के टुकड़ों को प्रभावी ढंग से एक सरल तरीके से हटाया जा सकता है, जिससे ईबी को सेंट्रीफ्यूजेशन से नुकसान होने से रोका जा सकता है। यह अध्ययन सेरेब्रल ऑर्गेनोइड संस्कृति के संचालन की सुविधा प्रदान करता है और मस्तिष्क ऑर्गेनोइड के आवेदन को बढ़ावा देने में मदद करता है।
Introduction
द्वि-आयामी (2 डी) संस्कृति प्रणालियों की तुलना में, त्रि-आयामी (3 डी) संस्कृति प्रणालियों के कई फायदे हैं, जिनमें वास्तविक प्रतिकृति और कुछ अंगों की जटिल संरचनाओं का कुशल प्रजननशामिल है 1. इसलिए, सेरेब्रल ऑर्गेनोइड मानव मस्तिष्क के विकास और रोग 2, दवा स्क्रीनिंग और सेल थेरेपी के अनुसंधान क्षेत्रों के लिए महत्वपूर्ण सहायक तरीकों मेंसे एक हैं।
घूर्णन निलंबन विधि द्वारा सेरेब्रल ऑर्गेनोइड संवर्धन उनके विकास और परिपक्वता के लिए अनुकूल है3. यद्यपि सेरेब्रल ऑर्गेनोइड संस्कृति प्रणालियों ने बड़ी सफलता हासिल की है, फिर भी उन्हें महत्वपूर्ण चुनौतियों का सामना करना पड़ता है जो उनके आवेदन को सीमित करते हैं। उदाहरण के लिए, मैनुअल खेती में जटिल हेरफेर कदम शामिल हैं और बड़े पैमाने पर अनुप्रयोगों को प्राप्त करने के लिए बाधाओं का परिचय देता है। इसके अतिरिक्त, सेरेब्रल ऑर्गेनोइड की संस्कृति में प्रत्येक विकास चरण में, विभिन्न मीडिया और साइटोकिन्स में परिवर्तन की आवश्यकता होतीहै 4. हालांकि, प्रारंभिक अवस्था में, ऑर्गेनोइड या ईबी के छोटे आकार (लगभग 200 μm से 300 μm) होते हैं और उपयुक्त उपकरण के बिना लगभग नेत्रहीन दुर्गम होते हैं। अनिवार्य रूप से, जब माध्यम बदल जाता है तो कीमती ऑर्गेनोइड नमूनों की एक निश्चित मात्रा को दूर कर दिया जाता है। अन्य प्रकार की ऑर्गेनोइड संस्कृतियों में इसे दूर करने के लिए कई तकनीकों का पता लगाया गया है, और कुछ उदाहरणों में हस्तक्षेप के बिना 3 दिनों के लिए संस्कृति माध्यम में पूरे ऑर्गेनोइड चिप्स को विसर्जित करना शामिलहै 5; शोषक पेपर5 का उपयोग करके पुराने माध्यम को अवशोषित करने के बाद कवरस्लिप के माध्यम से एक ताजा माध्यम जोड़ना; या द्रव विनिमय 6,7,8 के लिए जटिल माइक्रोफ्लुइडिक पाइपलाइनों को लागू करना। ऑर्गेनोइड खेती के शुरुआती चरण में सामना की जाने वाली एक और बाधा नग्न आंखों के साथ प्रत्यक्ष टिप्पणियों को प्राप्त करने में कठिनाई है, जो खराब संचालन का कारण बन सकती है जो ऑर्गेनोइड हस्तांतरण चरणों के दौरान ऑर्गेनोइड क्षति और हानि का कारण बनती है। इसलिए, एक अधिक व्यवहार्य प्रोटोकॉल स्थापित करना आवश्यक है जो ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए मध्यम परिवर्तन और ऑर्गेनोइड हस्तांतरण की सुविधा प्रदान करता है।
इंजीनियरिंग सिद्धांतों के आधार पर एक संबंधित अनुकूलित ऑपरेशन इन समस्याओं को दूर करने के लिए प्रस्तावित है, जो कई ऑर्गेनोइड प्रक्रियाओं को काफी और आसानी से सुविधाजनक बनाता है। प्रकृति में, जब सूरज खिड़की के अंतराल के माध्यम से एक घर में चमकता है, तो नग्न आंखें प्रकाश किरण में नृत्य करने वाली धूल को देख सकती हैं। धूल पर सूरज की रोशनी के फैलाने वाले प्रतिबिंब के कारण, एक दृश्य छवि का उत्पादन करने के लिए नेत्रगोलक में कुछ प्रकाश अपवर्तित होता है। इस घटना 9,10 के सिद्धांत से प्रेरित होकर, इस अध्ययन ने एक नरम प्रकाश दीपक बनाया और ईबी को पार्श्व रूप से रोशन किया। यह पाया गया कि ईबी देखने के दायरे को प्रभावित किए बिना नेत्रहीन रूप से स्पष्ट हो सकते हैं। केंद्र की ओर इशारा करते हुए एक माध्यमिक प्रवाह भंवर धाराओं के कारण संस्कृति प्लेट को घूर्णन करके तरल में उत्पन्न होता है11. मूल रूप से बिखरे हुए ईबी प्लेट के केंद्र में जमा होते हैं। इस आधार पर, और घटना है कि ऑर्गेनोइड का अवसादन वेग कोशिकाओं की तुलना में तेज है, सेंट्रीफ्यूजेशन के बिना मध्यम परिवर्तन और ऑर्गेनोइड हस्तांतरण की एक आसान संचालन विधि प्रस्तावित है। संस्कृति माध्यम में ऑर्गेनोइड को इस हस्तांतरण ऑपरेशन के माध्यम से मुक्त कोशिकाओं और मृत कोशिका टुकड़ों से प्रभावी ढंग से अलग किया जा सकता है।
यहां, एक प्रोटोकॉल जो संचालित करना आसान है, मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से सेरेब्रल ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए प्रस्तावित है। ऑपरेशन तकनीक को इंजीनियरिंग सिद्धांत को लागू करके अनुकूलित किया गया था, जिससे 3 डी संस्कृति में संचालन 2 डी संस्कृति के रूप में सरल और व्यवहार्य हो गया था। बेहतर तरल विनिमय विधि और ऑर्गेनॉइड ट्रांसफर ऑपरेशन अन्य प्रकार के ऑर्गेनोइड संस्कृति और स्वचालित संस्कृति मशीनों के डिजाइन के लिए भी सहायक हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
सेरेब्रल ऑर्गेनोइड चिकित्सा अनुसंधान के लिए नए रास्ते खोलते हैं। इस तकनीक के कई उपयोगी अनुप्रयोगों का पता लगाया जाना शुरू हो गयाहै 28. इस शोध में पाया गया कि आनुवंशिक रूप से रोगग्रस्त सेरेब्रल…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को गुआंग्डोंग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 2020 ए0505100062), गुआंगज़ौ सिटी साइंस एंड टेक्नोलॉजी की टॉपिक्स प्रोजेक्ट (ग्रांट नंबर 201904020025), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (ग्रांट नंबर 31872800, 32070582, 82101937), और गुआंगज़ौ सिटी पोस्टडॉक्टरल रिसर्च ग्रांट प्रोजेक्ट (बंगझू चेन के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.2 μm Filter | NEST Biotechnology, China | 331001 | |
| 1000 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405163 | |
| 200 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck, Germany | 8057400005 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio, China | G1101 | |
| 6-well low adhesion plate | NEST Biotechnology, China | 703011 | It is used for EBs suspension cultures |
| Aaccute cell detachment solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07920 | It is used to digest iPSC into single cells. |
| AggreWell800 24-well | STEMCELL Technologies, Canada | 34811 | Microporous culture plate for EBs preparation. |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07010 | Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion |
| B27-vit. A supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 12587010 | |
| bFGF | Peprotech, USA | GMP100-18B | |
| BSA | Beyotime Biotechnology, China | ST025 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5810 R | It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates. |
| Cover glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 10212020C | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology, China | C1002 | Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11330032 | |
| ES-quality FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 10270106 | |
| Ficoll Paque | General Electric Company, USA | 17-5442-02 | Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method. |
| Gelatin | Sangon Bioteach, China | A609764 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 35050061 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17504044 | |
| Goat anti-Chicken IgY secondary antibody | Abcam, UK | ab150171 | Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Mouse IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150120 | Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150077 | Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Heparin | Merck, Germany | H3149 | |
| Horizontal shaker | Servicebio, China | DS-H200 | Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland). |
| Insulin | Merck, Germany | I9278-5ML | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific, USA | 10828028 | |
| Matrigel | Corning, USA | 354277 | Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature. |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, USA | 11140050 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies, Canada | 85850 | iPSC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17502048 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, USA | 21103049 | |
| OCT4 primary antibody | Abcam, UK | ab19857 | Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution. |
| Pathological frozen slicer | Leica, Germany | Leica CM1860 | |
| PAX6 primary antibody | Abcam, UK | ab78545 | Host: Mouse. Use at 1:100 dilution. |
| PBS | STEMCELL Technologies, Canada | 37350 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, USA | 15140122 | |
| PSC dissociation solution | Beijing Saibei Biotechnology, China | CA3001500 | Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage. |
| Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific, USA | A16518 | Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit. |
| Slide Glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 188105W | |
| Soft light lamp | NUT | NUT | A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8570 | Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8571 | Maturation Medium |
| Sucrose | Sangon Bioteach, China | A502792 | |
| Triton X-100 | Merck, Germany | X100 | |
| TUJ1 primary antibody | Abcam, UK | ab41489 | Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution. |
| Vaseline | Sangon Bioteach, China | A510146 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies, Canada | 72302 | Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS. |
| Weblink | |||
| Raw sequencing data | Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences | GSA-Human: HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
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