Facilitando a cultura organoide cerebral através da iluminação lateral da luz suave
Summary
Organoides cerebrais oferecem oportunidades sem precedentes para estudar o desenvolvimento de órgãos e a patologia da doença humana. Embora tenha sido alcançado grande sucesso com sistemas de cultura organoides cerebrais, ainda há dificuldades operacionais na aplicação dessa tecnologia. O presente protocolo descreve um procedimento organoide cerebral que facilita a mudança média e a transferência organoide.
Abstract
Atualmente, a tecnologia de cultura organoide cerebral ainda é complicada de operar e difícil de aplicar em larga escala. É necessário encontrar uma solução simples e prática. Portanto, um protocolo organoide cerebral mais viável é proposto no presente estudo. Para resolver o inevitável inconveniente na mudança média e na transferência organoide no estágio inicial, a pesquisa atual otimiza a tecnologia de operação aplicando o princípio da engenharia. Uma lâmpada de luz macia foi adotada para iluminar lateralmente as amostras do corpo embrionário (EB), permitindo que os EBs fossem vistos a olho nu através do efeito de reflexão difusa aprimorado. Utilizando o princípio do fluxo secundário gerado pela rotação, os organoides se reúnem em direção ao centro do poço, o que facilita o funcionamento de mudança média ou transferência organoide. Comparado com a célula dispersa, o corpo embrionário se instala mais rápido na pipeta. Usando este fenômeno, a maioria das células livres e fragmentos de células mortas podem ser efetivamente removidos de forma simples, impedindo que os EBs incorram em danos causados por centrifugação. Este estudo facilita o funcionamento da cultura organoide cerebral e ajuda a promover a aplicação de organoides cerebrais.
Introduction
Em comparação com sistemas de cultura bidimensionais (2D), sistemas de cultura tridimensionais (3D) têm várias vantagens, incluindo replicação genuína e reprodução eficiente de estruturas complexas de determinados órgãos1. Portanto, organoides cerebrais são um dos importantes métodos auxiliares para os campos de pesquisa do desenvolvimento cerebral humano e da doença2, rastreamento de drogas e terapia celular.
A colheita de organoides cerebrais pelo método de suspensão rotativa é propícia ao seu desenvolvimento e maturação3. Embora os sistemas de cultura organoide cerebral tenham alcançado grande sucesso, eles ainda enfrentam desafios críticos que limitam sua aplicação. Por exemplo, o cultivo manual envolve etapas complicadas de manipulação e introduz obstáculos para alcançar aplicações em larga escala. Além disso, em cada estágio de desenvolvimento na cultura dos organoides cerebrais, são necessárias mudanças em diferentes mídias e citocinas4. No entanto, no estágio inicial, os organoides ou EBs têm tamanhos minúsculos (aproximadamente 200 μm a 300 μm) e são quase visualmente inacessíveis sem aparelhos apropriados. Inevitavelmente, uma certa quantidade de amostras organoides preciosas são lavadas quando o meio é alterado. Muitas técnicas têm sido exploradas para superar isso em outros tipos de culturas organoides, e alguns exemplos incluem a imersão de chips organoides inteiros em um meio de cultura por 3 dias sem intervenção5; adicionando um meio fresco através do deslizamento de tampas depois que o meio antigo é absorvido usando papel absorvente5; ou aplicar dutos microfluidos complexos para troca de fluidos 6,7,8. Outro obstáculo encontrado no estágio inicial do cultivo organoide é a dificuldade de alcançar observações diretas a olho nu, o que pode causar más operações que levam a danos organoides e perda durante as etapas de transferência organoide. Portanto, é necessário estabelecer um protocolo mais viável que facilite a mudança média e a transferência organoide para gerar organoides.
Propõe-se uma operação otimizada correspondente com base nos princípios da engenharia para superar esses problemas, o que facilita significativa e convenientemente muitos procedimentos organoides. Na natureza, quando o sol brilha em uma casa através de uma abertura de janela, o olho nu pode ver a poeira dançando no feixe de luz. Devido ao reflexo difuso da luz solar sobre a poeira, alguma luz é refratada no globo ocular para produzir uma imagem visual. Inspirado no princípio desse fenômeno 9,10, este estudo fez uma lâmpada de luz macia e iluminou os EBs lateralmente. Verificou-se que os EBs poderiam ser visualmente claros sem afetar o escopo de visualização. Um fluxo secundário apontando para o centro é gerado no líquido girando a placa de cultura devido às correntes de eddy11. EBs originalmente dispersos se acumulam no centro da placa. Com base nisso, e no fenômeno de que a velocidade de sedimentação dos organoides é mais rápida que a das células, propõe-se um método de operação fácil de mudança média e transferência organoide sem centrifugação. Os organoides no meio da cultura podem ser efetivamente separados de células livres e fragmentos de células mortas através desta operação de transferência.
Aqui, um protocolo de fácil funcionamento é proposto para gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes humanas. A tecnologia de operação foi otimizada aplicando o princípio da engenharia, tornando as operações na cultura 3D tão simples e viáveis quanto as da cultura 2D. O método de troca de líquidos melhorado e a operação de transferência organoide também são úteis para outros tipos de cultura organoide e o projeto de máquinas de cultura automática.
Protocol
Representative Results
Discussion
Organoides cerebrais abrem novos caminhos para a pesquisa médica. Muitas aplicações úteis desta tecnologia estão apenas começando a ser exploradas28. Esta pesquisa constatou que os resultados de sequenciamento de transcritos de organoides cerebrais geneticamente doentes e organoides cerebrais normais podem refletir as diferenças entre doença e saúde. Por exemplo, os resultados da análise de dados do RNA-seq (Figura 3B) são consistentes com muitos estudos re…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pela Fundação de Ciência Natural da Província de Guangdong (Grant No. 2020A0505100062), o Projeto de Temas-Chave de Ciência e Tecnologia da Cidade de Guangzhou (Grant No. 201904020025), a Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Grant No. 31872800, 32070582, 82101937) e o projeto Guangzhou City Postdoctor Research Grant (para Bangzhu Chen).
Materials
| 0.2 μm Filter | NEST Biotechnology, China | 331001 | |
| 1000 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405163 | |
| 200 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck, Germany | 8057400005 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio, China | G1101 | |
| 6-well low adhesion plate | NEST Biotechnology, China | 703011 | It is used for EBs suspension cultures |
| Aaccute cell detachment solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07920 | It is used to digest iPSC into single cells. |
| AggreWell800 24-well | STEMCELL Technologies, Canada | 34811 | Microporous culture plate for EBs preparation. |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07010 | Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion |
| B27-vit. A supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 12587010 | |
| bFGF | Peprotech, USA | GMP100-18B | |
| BSA | Beyotime Biotechnology, China | ST025 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5810 R | It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates. |
| Cover glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 10212020C | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology, China | C1002 | Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11330032 | |
| ES-quality FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 10270106 | |
| Ficoll Paque | General Electric Company, USA | 17-5442-02 | Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method. |
| Gelatin | Sangon Bioteach, China | A609764 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 35050061 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17504044 | |
| Goat anti-Chicken IgY secondary antibody | Abcam, UK | ab150171 | Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Mouse IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150120 | Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150077 | Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Heparin | Merck, Germany | H3149 | |
| Horizontal shaker | Servicebio, China | DS-H200 | Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland). |
| Insulin | Merck, Germany | I9278-5ML | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific, USA | 10828028 | |
| Matrigel | Corning, USA | 354277 | Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature. |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, USA | 11140050 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies, Canada | 85850 | iPSC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17502048 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, USA | 21103049 | |
| OCT4 primary antibody | Abcam, UK | ab19857 | Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution. |
| Pathological frozen slicer | Leica, Germany | Leica CM1860 | |
| PAX6 primary antibody | Abcam, UK | ab78545 | Host: Mouse. Use at 1:100 dilution. |
| PBS | STEMCELL Technologies, Canada | 37350 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, USA | 15140122 | |
| PSC dissociation solution | Beijing Saibei Biotechnology, China | CA3001500 | Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage. |
| Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific, USA | A16518 | Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit. |
| Slide Glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 188105W | |
| Soft light lamp | NUT | NUT | A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8570 | Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8571 | Maturation Medium |
| Sucrose | Sangon Bioteach, China | A502792 | |
| Triton X-100 | Merck, Germany | X100 | |
| TUJ1 primary antibody | Abcam, UK | ab41489 | Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution. |
| Vaseline | Sangon Bioteach, China | A510146 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies, Canada | 72302 | Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS. |
| Weblink | |||
| Raw sequencing data | Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences | GSA-Human: HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
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