Isolamento e analisi di vescicole extracellulari tracciabili e funzionalizzate dal plasma e dai tessuti solidi

Summary

Il presente protocollo descrive un metodo per estrarre vescicole extracellulari dal sangue periferico e dai tessuti solidi con successiva profilazione degli antigeni di superficie e dei carichi proteici.

Abstract

Le vescicole extracellulari circolanti e residenti nei tessuti (EV) rappresentano obiettivi promettenti come nuovi biomarcatori teranostici ed emergono come attori importanti nel mantenimento dell’omeostasi dell’organismo e nella progressione di un ampio spettro di malattie. Mentre la ricerca attuale si concentra sulla caratterizzazione degli esosomi endogeni di origine endosomiale, le microvescicole che sbiancano dalla membrana plasmatica hanno guadagnato crescente attenzione nella salute e nella malattia, che sono caratterizzate da un’abbondanza di molecole superficiali che ricapitolano la firma della membrana delle cellule madri. Qui viene presentata una procedura riproducibile basata sulla centrifugazione differenziale per estrarre e caratterizzare le EV dal plasma e dai tessuti solidi, come l’osso. Il protocollo descrive inoltre la successiva profilazione degli antigeni di superficie e dei carichi proteici delle EV, che sono quindi tracciabili per le loro derivazioni e identificati con componenti correlate alla funzione potenziale. Questo metodo sarà utile per l’analisi correlata, funzionale e meccanicistica delle EV in studi biologici, fisiologici e patologici.

Introduction

Le vescicole extracellulari (EV) sono state proposte per definire strutture extracellulari a doppio strato lipidico rilasciate dalle cellule¹, che svolgono ruoli importanti in vari eventi fisiologici e patologici². Le EV rilasciate da cellule sane possono essere ampiamente suddivise in due categorie principali, vale a dire esosomi (o piccole EV) formati attraverso una via di traffico endocitico intracellulare³ e microvescicole (o grandi EV) sviluppate dal germogliamento verso l’esterno della membrana plasmatica della cellula⁴. Mentre molti studi si concentrano sulla funzione delle EV raccolte da cellule in coltura in vitro⁵, le EV derivate dalla circolazione o dai tessuti sono più complesse ed eterogenee, che hanno il vantaggio di riflettere il vero stato dell’organismo in vivo⁶. Inoltre, quasi tutti i tipi di tessuti possono produrre EV in vivo , e questi EV possono agire come messaggeri all’interno del tessuto o essere trasferiti da vari fluidi corporei, in particolare il sangue periferico, per facilitare la comunicazione sistemica⁷. Anche i veicoli elettrici nella circolazione e nei tessuti sono bersagli per la diagnosi e il trattamento delle malattie⁸.

Mentre gli esosomi sono stati intensamente studiati negli ultimi anni, le microvescicole hanno anche importanti funzioni biologiche, che possono essere facilmente estratte senza ultracentrifugazione, promuovendo così la ricerca di base e clinica⁹. In particolare, un problema critico per quanto riguarda le EV isolate dalla circolazione e dai tessuti è che derivano da diversi tipi di cellule¹⁰. Poiché le microvescicole sono eliminate dalla membrana plasmatica e caratterizzate da un’abbondanza di molecole della superficie cellulare⁹, è possibile utilizzare marcatori della membrana cellulare madre per identificare l’origine cellulare di questi EV. In particolare, la tecnica di citometria a flusso (FC) può essere applicata per rilevare marcatori di membrana. Inoltre, i ricercatori possono isolare i veicoli elettrici e fare ulteriori analisi basate sui carichi funzionali.

Il presente protocollo fornisce una procedura completa per l’estrazione e la caratterizzazione delle EV da campioni in vivo. Gli EV sono isolati tramite centrifugazione differenziale e la caratterizzazione dei veicoli elettrici include l’identificazione morfologica tramite analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM), analisi dell’origine tramite FC e analisi del carico proteico tramite western blot. Il plasma sanguigno e l’osso mascellare dei topi sono usati come rappresentanti. I ricercatori possono fare riferimento a questo protocollo per i veicoli elettrici da altre fonti e apportare le modifiche corrispondenti.

Protocol

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali della quarta università medica militare e le linee guida ARRIVE. Per il presente studio, sono stati utilizzati topi C57Bl / 6 di 8 settimane (nessuna preferenza per femmine o maschi). Le fasi coinvolte nell’isolamento delle EV plasmatiche e tissutali sono illustrate nella Figura 1. Il plasma è preso come rappresentante per descrivere la procedura …

Representative Results

Secondo il flusso di lavoro sperimentale, le EV possono essere estratte dal sangue periferico e dai tessuti solidi (Figura 1). L’osso mascellare di un topo di 8 settimane è di circa 0,1 ± 0,05 g e circa 300 μL di plasma possono essere raccolti dal topo. Seguendo le fasi del protocollo, è possibile raccogliere rispettivamente 0,3 mg e 3 μg di EV. Come analizzato da TEM e NTA, le caratteristiche morfologiche tipiche delle EV sono vescicole rotonde a membrana a forma di coppa con un diamet…

Discussion

Quando si studiano le caratteristiche, il destino e la funzione dei veicoli elettrici, è fondamentale isolare i veicoli elettrici con alta resa e bassa contaminazione. Esistono vari metodi per estrarre EV, come la centrifugazione a gradiente di densità (DGC), la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) e i saggi di immunocattura ^4,20. Qui è stato utilizzato uno dei metodi più comunemente usati, la centrifugazione differenziale; i vantaggi di questo sono…

Materials

4% paraformaldehyde	Biosharp	143174	Transmission electron microscope
Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody	Yeason	34306ES60	Flow cytometry
Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen	A11008	Flow cytometry
Anti-CD18 antibody	Abcam	ab131044	Flow cytometry
Anti-CD81 antibody	Abcam	ab109201	Western blot
anti-CD9 antibody	Huabio	ET1601-9	Western blot
Anti-Mitofilin antibody	Abcam	ab110329	Western blot
APOA1 Rabbit pAb	Abclone	A14211	Western blot
BCA protein assay kit	TIANGEN	PA115	Western blot
BLUeye Prestained Protein Ladder	Sigma-Aldrich	94964-500UL	Western blot
Bovine serum albumin	MP Biomedical	218072801	Western blot
Caveolin-1 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-53564	Western blot
CellMask Orange plasma membrane stain	Invitrogen	C10045	Flow cytometry
Chemiluminescence	Amersham Biosciences	N/A	Western blot
Curved operating scissor	JZ Surgical Instrument	J21040	EV isolation
Electronic balance	Zhi Ke	ZK-DST	EV isolation
Epoch spectrophotometer	BioTek	N/A	Western blot
Eppendorf tubes	Eppendorf	3810X	EV isolation
Flotillin-1 antibody	PTM BIO	PTM-5369	Western blot
Gel imaging system	Tanon	4600	Western blot
Golgin84	Novus	nbp1-83352	Western blot
Grids – Formvar/Carbon Coated – Copper 200 mesh	Polysciences	24915	Transmission electron microscope
Heparin Solution	StemCell	7980	EV isolation
Liberase Research Grade	Sigma-Aldrich	5401127001	EV isolation
Microscopic tweezer	JZ Surgical Instrument	JD1020	EV isolation
NovoCyte flow cytometer	ACEA	N/A	Flow cytometry
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells	Epizyme	LK206	Western blot
OSCAR(D-19) antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-34235	Flow cytometry
PBS (2x)	ZHHC	PW013	Western blot
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	57-33-0	Anesthetization
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jacson	115-035-003	Western blot
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jacson	111-035-003	Western blot
Phosphotungstic acid	RHAWN	12501-23-4	Transmission electron microscope
PKM2(d78a4) xp rabbit  mab	Cell Signaling	4053t	Western blot
Polyethylene (PE) film	Xiang yi	200150055	Transmission electron microscope
Polyvinylidene fluoride membranes	Roche	3010040001	Western blot
Protease inhibitors	Roche	4693132001	Western blot
Recombinant anti-PGD antibody	Abcam	ab129199	Western blot
RIPA lysis buffer	Beyotime	P0013	Western blot
SDS-PAGE loading buffer (5x)	Cwbio	CW0027S	Western blot
Size beads	Invitrogen	F13839	Flow cytometry
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges	Hitachi	CT15E	EV isolation
Transmission electron microscope	HITACHI	H-7650	Transmission electron microscope
Tween-20	MP Biomedicals	19472	Western blot
Vortex Mixer Genie	Scientific Industries	SI0425	EV isolation
ZetaView BASIC NTA – Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120	Particle Metrix	N/A	Nanoparticle tracking analysis
α-Actinin-4 Rabbit mAb	Abclone	A3379	Western blot
β-actin	Cwbio	CW0096M	Western blot