Isolatie en analyse van traceerbare en gefunctionaliseerde extracellulaire blaasjes uit het plasma en vaste weefsels

Summary

Het huidige protocol beschrijft een methode om extracellulaire blaasjes uit het perifere bloed en vaste weefsels te extraheren met daaropvolgende profilering van oppervlakteantigenen en eiwitladingen.

Abstract

Circulerende en weefsel-residente extracellulaire blaasjes (EV’s) vertegenwoordigen veelbelovende doelen als nieuwe theranostische biomarkers, en ze komen naar voren als belangrijke spelers in het onderhoud van organismale homeostase en de progressie van een breed spectrum van ziekten. Terwijl het huidige onderzoek zich richt op de karakterisering van endogene exosomen met de endosomale oorsprong, hebben microvesicles die uit het plasmamembraan blossen steeds meer aandacht gekregen in gezondheid en ziekte, die worden gekenmerkt door een overvloed aan oppervlaktemoleculen die de membraansignatuur van oudercellen samenvatten. Hier wordt een reproduceerbare procedure gepresenteerd op basis van differentiële centrifugatie voor het extraheren en karakteriseren van EV’s uit het plasma en vaste weefsels, zoals het bot. Het protocol beschrijft verder de daaropvolgende profilering van oppervlakteantigenen en eiwitladingen van EV’s, die dus traceerbaar zijn voor hun afleidingen en geïdentificeerd met componenten die verband houden met de potentiële functie. Deze methode zal nuttig zijn voor correlatieve, functionele en mechanistische analyse van EV’s in biologische, fysiologische en pathologische studies.

Introduction

Extracellulaire blaasjes (EV’s) zijn voorgesteld om cel-vrijgegeven lipide bilayer-omsloten extracellulaire structuren¹ te definiëren, die een belangrijke rol spelen bij verschillende fysiologische en pathologische gebeurtenissen². EV’s die door gezonde cellen worden vrijgegeven, kunnen grofweg worden onderverdeeld in twee hoofdcategorieën, namelijk exosomen (of kleine EV’s) gevormd door een intracellulaire endocytische handelsroute³ en microvesicles (of grote EV’s) ontwikkeld door de uitwendige ontluiking van het plasmamembraan van de cel⁴. Hoewel veel studies zich richten op de functie van EV’s verzameld uit gekweekte cellen in vitro⁵, zijn EV’s afgeleid van de circulatie of weefsels complexer en heterogener, die het voordeel hebben dat ze de ware toestand van het organisme in vivo^{weerspiegelen 6}. Bovendien kunnen bijna alle soorten weefsels EV’s in vivo produceren, en deze EV’s kunnen fungeren als boodschappers in het weefsel of worden overgedragen door verschillende lichaamsvloeistoffen, vooral het perifere bloed, om systemische communicatie te vergemakkelijken⁷. EV’s in de bloedsomloop en weefsels zijn ook doelwitten voor ziektediagnose en -behandeling⁸.

Terwijl exosomen de afgelopen jaren intensief zijn bestudeerd, hebben microvesicles ook belangrijke biologische functies, die gemakkelijk kunnen worden geëxtraheerd zonder ultracentrifugatie, waardoor fundamenteel en klinisch onderzoek wordt bevorderd⁹. Met name een kritiek probleem met betrekking tot EV’s geïsoleerd uit de bloedsomloop en weefsels is dat ze zijn afgeleid van verschillende celtypen¹⁰. Aangezien microvesicles uit het plasmamembraan worden gespoeld en worden gekenmerkt door een overvloed aan celoppervlakmoleculen⁹, is het gebruik van oudercelmembraanmarkers om de cellulaire oorsprong van deze EV’s te identificeren haalbaar. Concreet kan de flowcytometrie (FC) techniek worden toegepast om membraanmarkers te detecteren. Bovendien kunnen onderzoekers de EV’s isoleren en verdere analyses maken op basis van de functionele ladingen.

Het huidige protocol voorziet in een grondige procedure voor het extraheren en karakteriseren van EV’s uit in vivo monsters. De EV’s worden geïsoleerd via differentiële centrifugatie en de karakterisering van EV’s omvat morfologische identificatie via nanodeeltjesvolganalyse (NTA) en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), oorsprongsanalyse via FC en eiwitladinganalyse via western blot. Het bloedplasma en het maxillaire bot van muizen worden gebruikt als vertegenwoordigers. Onderzoekers kunnen dit protocol raadplegen voor EV’s uit andere bronnen en overeenkomstige wijzigingen aanbrengen.

Protocol

De dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Guidelines of Institutional Animal Care and Use Committee van de Fourth Military Medical University en de ARRIVE-richtlijnen. Voor de huidige studie werden 8 weken oude C57Bl/6-muizen (geen voorkeur voor vrouwtjes of mannetjes) gebruikt. De stappen die betrokken zijn bij het isoleren van plasma- en weefsel-EV’s worden geïllustreerd in figuur 1. Het plasma wordt als een vertegenwoordiger genomen om de EV-isolatieprocedure van lichaam…

Representative Results

Volgens de experimentele workflow kunnen EV’s worden geëxtraheerd uit het perifere bloed en vaste weefsels (figuur 1). Het maxillaire bot van een muis van 8 weken oud is ongeveer 0,1 ± 0,05 g en ongeveer 300 μL plasma kan uit de muis worden verzameld. Volgens de protocolstappen kan respectievelijk 0,3 mg en 3 μg EV’s worden verzameld. Zoals geanalyseerd door TEM en NTA, zijn de typische morfologische kenmerken van EV’s ronde bekervormige membraanblaasjes met een diameter variërend van 5…

Discussion

Bij het bestuderen van de kenmerken, het lot en de functie van EV’s is het cruciaal om EV’s met een hoge opbrengst en lage vervuiling te isoleren. Er bestaan verschillende methoden om EV’s te extraheren, zoals dichtheidsgradiëntcentrifugatie (DGC), grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) en immunocapture-assays ^4,20. Hier werd een van de meest gebruikte methoden, differentiële centrifugatie, gebruikt; de voordelen hiervan zijn dat het niet tijdrovend is, het g…

Materials

4% paraformaldehyde	Biosharp	143174	Transmission electron microscope
Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody	Yeason	34306ES60	Flow cytometry
Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen	A11008	Flow cytometry
Anti-CD18 antibody	Abcam	ab131044	Flow cytometry
Anti-CD81 antibody	Abcam	ab109201	Western blot
anti-CD9 antibody	Huabio	ET1601-9	Western blot
Anti-Mitofilin antibody	Abcam	ab110329	Western blot
APOA1 Rabbit pAb	Abclone	A14211	Western blot
BCA protein assay kit	TIANGEN	PA115	Western blot
BLUeye Prestained Protein Ladder	Sigma-Aldrich	94964-500UL	Western blot
Bovine serum albumin	MP Biomedical	218072801	Western blot
Caveolin-1 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-53564	Western blot
CellMask Orange plasma membrane stain	Invitrogen	C10045	Flow cytometry
Chemiluminescence	Amersham Biosciences	N/A	Western blot
Curved operating scissor	JZ Surgical Instrument	J21040	EV isolation
Electronic balance	Zhi Ke	ZK-DST	EV isolation
Epoch spectrophotometer	BioTek	N/A	Western blot
Eppendorf tubes	Eppendorf	3810X	EV isolation
Flotillin-1 antibody	PTM BIO	PTM-5369	Western blot
Gel imaging system	Tanon	4600	Western blot
Golgin84	Novus	nbp1-83352	Western blot
Grids – Formvar/Carbon Coated – Copper 200 mesh	Polysciences	24915	Transmission electron microscope
Heparin Solution	StemCell	7980	EV isolation
Liberase Research Grade	Sigma-Aldrich	5401127001	EV isolation
Microscopic tweezer	JZ Surgical Instrument	JD1020	EV isolation
NovoCyte flow cytometer	ACEA	N/A	Flow cytometry
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells	Epizyme	LK206	Western blot
OSCAR(D-19) antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-34235	Flow cytometry
PBS (2x)	ZHHC	PW013	Western blot
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	57-33-0	Anesthetization
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jacson	115-035-003	Western blot
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jacson	111-035-003	Western blot
Phosphotungstic acid	RHAWN	12501-23-4	Transmission electron microscope
PKM2(d78a4) xp rabbit  mab	Cell Signaling	4053t	Western blot
Polyethylene (PE) film	Xiang yi	200150055	Transmission electron microscope
Polyvinylidene fluoride membranes	Roche	3010040001	Western blot
Protease inhibitors	Roche	4693132001	Western blot
Recombinant anti-PGD antibody	Abcam	ab129199	Western blot
RIPA lysis buffer	Beyotime	P0013	Western blot
SDS-PAGE loading buffer (5x)	Cwbio	CW0027S	Western blot
Size beads	Invitrogen	F13839	Flow cytometry
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges	Hitachi	CT15E	EV isolation
Transmission electron microscope	HITACHI	H-7650	Transmission electron microscope
Tween-20	MP Biomedicals	19472	Western blot
Vortex Mixer Genie	Scientific Industries	SI0425	EV isolation
ZetaView BASIC NTA – Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120	Particle Metrix	N/A	Nanoparticle tracking analysis
α-Actinin-4 Rabbit mAb	Abclone	A3379	Western blot
β-actin	Cwbio	CW0096M	Western blot