Isolierung und Analyse von nachweisbaren und funktionalisierten extrazellulären Vesikeln aus dem Plasma und festen Geweben

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Extraktion extrazellulärer Vesikel aus dem peripheren Blut und festem Gewebe mit anschließender Profilierung von Oberflächenantigenen und Proteinladungen.

Abstract

Zirkulierende und geweberesidente extrazelluläre Vesikel (EVs) stellen vielversprechende Ziele als neuartige theranostische Biomarker dar und erweisen sich als wichtige Akteure bei der Aufrechterhaltung der organismischen Homöostase und dem Fortschreiten eines breiten Spektrums von Krankheiten. Während sich die aktuelle Forschung auf die Charakterisierung endogener Exosomen mit endosomalem Ursprung konzentriert, haben Mikrovesikel, die aus der Plasmamembran blähen, zunehmend an Aufmerksamkeit in den Bereichen Gesundheit und Krankheit gewonnen, die sich durch eine Fülle von Oberflächenmolekülen auszeichnen, die die Membransignatur von Elternzellen rekapitulieren. In dieser Arbeit wird ein reproduzierbares Verfahren vorgestellt, das auf der Differentialzentrifugation basiert, um EVs aus dem Plasma und festen Geweben, wie z.B. dem Knochen, zu extrahieren und zu charakterisieren. Das Protokoll beschreibt darüber hinaus die anschließende Profilierung von Oberflächenantigenen und Proteinladungen von EVs, die somit auf ihre Ableitungen zurückgeführt und mit Komponenten identifiziert werden können, die mit einer potenziellen Funktion in Verbindung stehen. Diese Methode wird für die korrelative, funktionelle und mechanistische Analyse von EVs in biologischen, physiologischen und pathologischen Studien nützlich sein.

Introduction

Extrazelluläre Vesikel (EVs) wurden vorgeschlagen, um zellfreigesetzte Lipiddoppelschicht-eingeschlossene extrazelluläre Strukturen^{zu definieren 1}, die eine wichtige Rolle bei verschiedenen physiologischen und pathologischen Ereignissen^{spielen 2}. EVs, die von gesunden Zellen freigesetzt werden, können grob in zwei Hauptkategorien unterteilt werden, nämlich Exosomen (oder kleine EVs), die durch einen intrazellulären endozytären Transportweg³ gebildet werden, und Mikrovesikel (oder große EVs), die durch die nach außen gerichtete Knospung der Plasmamembran der Zelle⁴ entstehen. Während sich viele Studien auf die Funktion von EVs konzentrieren, die aus kultivierten Zellen in vitro⁵ gewonnen wurden, sind EVs, die aus dem Kreislauf oder Gewebe stammen, komplexer und heterogener, was den Vorteil hat, dass sie den wahren Zustand des Organismus in vivo widerspiegeln ⁶. Darüber hinaus können fast alle Arten von Geweben EVs in vivo produzieren, und diese EVs können als Botenstoffe innerhalb des Gewebes fungieren oder von verschiedenen Körperflüssigkeiten, insbesondere dem peripheren Blut, übertragen werden, um die systemische Kommunikation zu erleichtern⁷. EVs im Kreislauf und im Gewebe sind auch Ziele für die Diagnose und Behandlung von Krankheiten⁸.

Während Exosomen in den letzten Jahren intensiv erforscht wurden, haben Mikrovesikel auch wichtige biologische Funktionen, die ohne Ultrazentrifugation leicht extrahiert werden können und so die Grundlagen- und klinische Forschung fördern⁹. Ein kritisches Problem in Bezug auf EVs, die aus dem Kreislauf und dem Gewebe isoliert wurden, besteht darin, dass sie von verschiedenen Zelltypen stammen¹⁰. Da Mikrovesikel von der Plasmamembran abgeblasen werden und durch eine Fülle von Zelloberflächenmolekülen⁹ gekennzeichnet sind, ist die Verwendung von Markern für die Mutterzellmembran zur Identifizierung des zellulären Ursprungs dieser EVs möglich. Insbesondere kann die Technik der Durchflusszytometrie (FC) zum Nachweis von Membranmarkern eingesetzt werden. Darüber hinaus können die Forscher die Elektrofahrzeuge isolieren und weitere Analysen auf der Grundlage der funktionalen Ladungen durchführen.

Das vorliegende Protokoll bietet ein gründliches Verfahren zur Extraktion und Charakterisierung von EVs aus in vivo Proben. Die EVs werden mittels Differentialzentrifugation isoliert, und die Charakterisierung der EVs umfasst die morphologische Identifizierung mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Herkunftsanalyse mittels FC und Proteinfrachtanalyse mittels Western Blot. Das Blutplasma und der Oberkieferknochen von Mäusen werden als Repräsentanten verwendet. Forscher können auf dieses Protokoll für Elektrofahrzeuge aus anderen Quellen zurückgreifen und entsprechende Änderungen vornehmen.

Protocol

Die Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Komitees für institutionelle Tierpflege und -nutzung der Vierten Militärmedizinischen Universität und den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt. Für die vorliegende Studie wurden 8 Wochen alte C57Bl/6-Mäuse (keine Präferenz für Weibchen oder Männchen) verwendet. Die Schritte zur Isolierung von Plasma- und Gewebe-EVs sind in Abbildung 1 dargestellt. Das Plasma wird als Repräsentant herangezogen, um das Verfahren zur Isoli…

Representative Results

Entsprechend dem experimentellen Arbeitsablauf können EVs aus dem peripheren Blut und festen Geweben extrahiert werden (Abbildung 1). Der Oberkieferknochen einer Maus im Alter von 8 Wochen beträgt ca. 0,1 ± 0,05 g, und es können ca. 300 μl Plasma aus der Maus entnommen werden. Nach den Protokollschritten können 0,3 mg bzw. 3 μg EVs gesammelt werden. Wie mittels TEM und NTA analysiert, sind die typischen morphologischen Merkmale von EVs runde becherförmige Membranvesikel mit einem Dur…

Discussion

Bei der Untersuchung der Merkmale, des Verbleibs und der Funktion von Elektrofahrzeugen ist es von entscheidender Bedeutung, Elektrofahrzeuge mit hoher Ausbeute und geringer Kontamination zu isolieren. Es gibt verschiedene Methoden zur Extraktion von EVs, wie z. B. Dichtegradientenzentrifugation (DGC), Größenausschlusschromatographie (SEC) und Immunocapture-Assays ^4,20. Hier kam eine der am häufigsten verwendeten Methoden, die Differentialzentrifugation, zum E…

Materials

4% paraformaldehyde	Biosharp	143174	Transmission electron microscope
Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody	Yeason	34306ES60	Flow cytometry
Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen	A11008	Flow cytometry
Anti-CD18 antibody	Abcam	ab131044	Flow cytometry
Anti-CD81 antibody	Abcam	ab109201	Western blot
anti-CD9 antibody	Huabio	ET1601-9	Western blot
Anti-Mitofilin antibody	Abcam	ab110329	Western blot
APOA1 Rabbit pAb	Abclone	A14211	Western blot
BCA protein assay kit	TIANGEN	PA115	Western blot
BLUeye Prestained Protein Ladder	Sigma-Aldrich	94964-500UL	Western blot
Bovine serum albumin	MP Biomedical	218072801	Western blot
Caveolin-1 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-53564	Western blot
CellMask Orange plasma membrane stain	Invitrogen	C10045	Flow cytometry
Chemiluminescence	Amersham Biosciences	N/A	Western blot
Curved operating scissor	JZ Surgical Instrument	J21040	EV isolation
Electronic balance	Zhi Ke	ZK-DST	EV isolation
Epoch spectrophotometer	BioTek	N/A	Western blot
Eppendorf tubes	Eppendorf	3810X	EV isolation
Flotillin-1 antibody	PTM BIO	PTM-5369	Western blot
Gel imaging system	Tanon	4600	Western blot
Golgin84	Novus	nbp1-83352	Western blot
Grids – Formvar/Carbon Coated – Copper 200 mesh	Polysciences	24915	Transmission electron microscope
Heparin Solution	StemCell	7980	EV isolation
Liberase Research Grade	Sigma-Aldrich	5401127001	EV isolation
Microscopic tweezer	JZ Surgical Instrument	JD1020	EV isolation
NovoCyte flow cytometer	ACEA	N/A	Flow cytometry
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells	Epizyme	LK206	Western blot
OSCAR(D-19) antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-34235	Flow cytometry
PBS (2x)	ZHHC	PW013	Western blot
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	57-33-0	Anesthetization
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jacson	115-035-003	Western blot
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jacson	111-035-003	Western blot
Phosphotungstic acid	RHAWN	12501-23-4	Transmission electron microscope
PKM2(d78a4) xp rabbit  mab	Cell Signaling	4053t	Western blot
Polyethylene (PE) film	Xiang yi	200150055	Transmission electron microscope
Polyvinylidene fluoride membranes	Roche	3010040001	Western blot
Protease inhibitors	Roche	4693132001	Western blot
Recombinant anti-PGD antibody	Abcam	ab129199	Western blot
RIPA lysis buffer	Beyotime	P0013	Western blot
SDS-PAGE loading buffer (5x)	Cwbio	CW0027S	Western blot
Size beads	Invitrogen	F13839	Flow cytometry
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges	Hitachi	CT15E	EV isolation
Transmission electron microscope	HITACHI	H-7650	Transmission electron microscope
Tween-20	MP Biomedicals	19472	Western blot
Vortex Mixer Genie	Scientific Industries	SI0425	EV isolation
ZetaView BASIC NTA – Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120	Particle Metrix	N/A	Nanoparticle tracking analysis
α-Actinin-4 Rabbit mAb	Abclone	A3379	Western blot
β-actin	Cwbio	CW0096M	Western blot