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Biologie

Aislamiento y análisis de vesículas extracelulares trazables y funcionalizadas a partir del plasma y tejidos sólidos

Published: October 17, 2022
doi:
10.3791/63990
, , , , , , , ,
1State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology,The Fourth Military Medical University, 2Department of Orthodontics, School of Stomatology,The Fourth Military Medical University, 3Department of VIP Dental Care, School of Stomatology,The Fourth Military Medical University, 4School of Basic Medicine,The Fourth Military Medical University, 5College of Life Science,Northwest University, 6Xi’an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine

Summary

El presente protocolo describe un método para extraer vesículas extracelulares de la sangre periférica y tejidos sólidos con el posterior perfil de antígenos de superficie y cargas de proteínas.

Abstract

Las vesículas extracelulares (EV) circulantes y residentes en tejidos representan objetivos prometedores como nuevos biomarcadores teranósticos, y emergen como actores importantes en el mantenimiento de la homeostasis del organismo y la progresión de un amplio espectro de enfermedades. Si bien la investigación actual se centra en la caracterización de exosomas endógenos con origen endosomal, las microvesículas que brotan de la membrana plasmática han ganado cada vez más atención en la salud y la enfermedad, que se caracterizan por una gran cantidad de moléculas de superficie que recapitulan la firma de membrana de las células madre. Aquí, se presenta un procedimiento reproducible basado en la centrifugación diferencial para extraer y caracterizar EVs del plasma y tejidos sólidos, como el hueso. El protocolo describe además el perfil posterior de antígenos de superficie y cargas de proteínas de EV, que por lo tanto son trazables para sus derivaciones e identificados con componentes relacionados con la función potencial. Este método será útil para el análisis correlativo, funcional y mecanicista de EV en estudios biológicos, fisiológicos y patológicos.

Introduction

Se han propuesto vesículas extracelulares (EV) para definir estructuras extracelulares liberadas por la bicapa lipídica liberada por células1, que desempeñan un papel importante en diversos eventos fisiológicos y patológicos2. Los EV liberados por las células sanas se pueden dividir ampliamente en dos categorías principales, a saber, exosomas (o EV pequeños) formados a través de una vía de tráfico endocítico intracelular3 y microvesículas (o EV grandes) desarrolladas por la gemación externa de la membrana plasmática de la célula4. Mientras que muchos estudios se centran en la función de las EV recolectadas a partir de células cultivadas in vitro5, las EV derivadas de la circulación o los tejidos son más complejas y heterogéneas, lo que tiene la ventaja de reflejar el verdadero estado del organismo in vivo6. Además, casi todos los tipos de tejidos pueden producir EVs in vivo , y estos EVs pueden actuar como mensajeros dentro del tejido o ser transferidos por diversos fluidos corporales, especialmente la sangre periférica, para facilitar la comunicación sistémica7. Las EV en la circulación y los tejidos también son objetivos para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades8.

Mientras que los exosomas han sido intensamente estudiados en los últimos años, las microvesículas también tienen importantes funciones biológicas, que pueden ser fácilmente extraídas sin ultracentrifugación, promoviendo así la investigación básica y clínica9. En particular, una cuestión crítica con respecto a las EV aisladas de la circulación y los tejidos es que se derivan de diferentes tipos de células10. Dado que las microvesículas son expulsadas de la membrana plasmática y se caracterizan por una abundancia de moléculas de superficie celular9, es factible utilizar marcadores de membrana celular parental para identificar el origen celular de estas EV. Específicamente, la técnica de citometría de flujo (FC) se puede aplicar para detectar marcadores de membrana. Además, los investigadores pueden aislar los vehículos eléctricos y realizar análisis adicionales basados en las cargas funcionales.

El presente protocolo proporciona un procedimiento exhaustivo para extraer y caracterizar EV de muestras in vivo. Los EV se aíslan mediante centrifugación diferencial, y la caracterización de los EV incluye la identificación morfológica mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y microscopía electrónica de transmisión (TEM), análisis de origen a través de FC y análisis de carga de proteínas mediante western blot. El plasma sanguíneo y el hueso maxilar de los ratones se utilizan como representantes. Los investigadores pueden consultar este protocolo para vehículos eléctricos de otras fuentes y realizar las modificaciones correspondientes.

Protocol

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las Directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Cuarta Universidad Médica Militar y las directrices de ARRIVE. Para el presente estudio, se utilizaron ratones C57Bl/6 de 8 semanas de edad (sin preferencia por hembras o machos). Los pasos involucrados en el aislamiento de EV de plasma y tejido se ilustran en la Figura 1. El plasma se toma como un representante para describir el procedimiento de aislamient…

Representative Results

De acuerdo con el flujo de trabajo experimental, los EV se pueden extraer de la sangre periférica y los tejidos sólidos (Figura 1). El hueso maxilar de un ratón de 8 semanas es de aproximadamente 0,1 ± 0,05 g, y se pueden recolectar aproximadamente 300 μL de plasma del ratón. Siguiendo los pasos del protocolo, se pueden recolectar 0,3 mg y 3 μg de EV, respectivamente. Según lo analizado por TEM y NTA, las características morfológicas típicas de los EV son vesículas de membrana re…

Discussion

Al estudiar las características, el destino y la función de los vehículos eléctricos, es crucial aislar los vehículos eléctricos con alto rendimiento y baja contaminación. Existen varios métodos para extraer EVs, como la centrifugación por gradiente de densidad (DGC), la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) y los ensayos de inmunocaptura 4,20. Aquí, se utilizó uno de los métodos más utilizados, la centrifugación diferencial; las ventajas de…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32000974, 81870796, 82170988 y 81930025) y la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (2019M663986 y BX20190380). Estamos agradecidos por la asistencia del Centro Nacional de Demostración de Enseñanza Experimental para Medicina Básica (AMFU).

Materials

4% paraformaldehyde  Biosharp 143174 Transmission electron microscope
Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody Yeason 34306ES60 Flow cytometry
Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody Invitrogen A11008 Flow cytometry
Anti-CD18 antibody Abcam ab131044 Flow cytometry
Anti-CD81 antibody Abcam ab109201 Western blot
anti-CD9 antibody Huabio ET1601-9 Western blot
Anti-Mitofilin antibody Abcam ab110329 Western blot
APOA1 Rabbit pAb Abclone A14211 Western blot
BCA protein assay kit TIANGEN PA115 Western blot
BLUeye Prestained Protein Ladder Sigma-Aldrich 94964-500UL Western blot
Bovine serum albumin MP Biomedical 218072801 Western blot
Caveolin-1 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-53564 Western blot
CellMask Orange plasma membrane stain Invitrogen C10045 Flow cytometry
Chemiluminescence Amersham Biosciences N/A Western blot
Curved operating scissor JZ Surgical Instrument J21040 EV isolation
Electronic balance Zhi Ke ZK-DST EV isolation
Epoch spectrophotometer BioTek N/A Western blot
Eppendorf tubes Eppendorf 3810X EV isolation
Flotillin-1 antibody PTM BIO PTM-5369 Western blot
Gel imaging system Tanon 4600 Western blot
Golgin84 Novus nbp1-83352 Western blot
Grids – Formvar/Carbon Coated – Copper 200 mesh Polysciences 24915 Transmission electron microscope
Heparin Solution StemCell  7980 EV isolation
Liberase Research Grade Sigma-Aldrich 5401127001 EV isolation
Microscopic tweezer JZ Surgical Instrument JD1020 EV isolation
NovoCyte flow cytometer ACEA N/A Flow cytometry
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells Epizyme LK206 Western blot
OSCAR(D-19) antibody Santa Cruz Biotechnology SC-34235 Flow cytometry
PBS (2x) ZHHC PW013 Western blot
Pentobarbital sodium Sigma-Aldrich 57-33-0 Anesthetization
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jacson 115-035-003 Western blot
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jacson 111-035-003 Western blot
Phosphotungstic acid RHAWN 12501-23-4 Transmission electron microscope
PKM2(d78a4) xp rabbit  mab  Cell Signaling 4053t Western blot
Polyethylene (PE) film Xiang yi 200150055 Transmission electron microscope
Polyvinylidene fluoride membranes  Roche 3010040001 Western blot
Protease inhibitors Roche 4693132001 Western blot
Recombinant anti-PGD antibody Abcam ab129199 Western blot
RIPA lysis buffer Beyotime P0013 Western blot
SDS-PAGE loading buffer (5x) Cwbio CW0027S Western blot
Size beads Invitrogen F13839 Flow cytometry
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges Hitachi CT15E EV isolation
Transmission electron microscope HITACHI H-7650 Transmission electron microscope
Tween-20 MP Biomedicals 19472 Western blot
Vortex Mixer Genie Scientific Industries SI0425 EV isolation
ZetaView BASIC NTA – Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 Particle Metrix N/A Nanoparticle tracking analysis
α-Actinin-4 Rabbit mAb Abclone A3379 Western blot
β-actin Cwbio CW0096M Western blot
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References

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Citer Cet Article
Cao, Y., Qiu, J., Chen, D., Li, C., Xing, S., Zheng, C., Liu, X., Jin, Y., Sui, B. Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues. J. Vis. Exp. (188), e63990, doi:10.3791/63990 (2022).
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