JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

Isolering och analys av spårbara och funktionaliserade extracellulära vesiklar från plasma och fasta vävnader

Published: October 17, 2022
doi:
10.3791/63990
, , , , , , , ,
1State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology,The Fourth Military Medical University, 2Department of Orthodontics, School of Stomatology,The Fourth Military Medical University, 3Department of VIP Dental Care, School of Stomatology,The Fourth Military Medical University, 4School of Basic Medicine,The Fourth Military Medical University, 5College of Life Science,Northwest University, 6Xi’an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine

Summary

Detta protokoll beskriver en metod för att extrahera extracellulära vesiklar från perifert blod och fast vävnad med efterföljande profilering av ytantigener och proteinlaster.

Abstract

Cirkulerande och vävnadsresidenta extracellulära vesiklar (EV) representerar lovande mål som nya teranostiska biomarkörer, och de framträder som viktiga aktörer i upprätthållandet av organismhomeostas och utvecklingen av ett brett spektrum av sjukdomar. Medan den aktuella forskningen fokuserar på karakterisering av endogena exosomer med endosomalt ursprung, har mikrovesiklar som blåser från plasmamembranet fått ökad uppmärksamhet vid hälsa och sjukdom, som presenteras av ett överflöd av ytmolekyler som rekapitulerar membransignaturen hos moderceller. Här presenteras en reproducerbar procedur baserad på differentiell centrifugering för att extrahera och karakterisera EV från plasma och fasta vävnader, såsom benet. Protokollet beskriver vidare efterföljande profilering av ytantigener och proteinlaster av EV, som därmed är spårbara för sina härledningar och identifierade med komponenter relaterade till potentiell funktion. Denna metod kommer att vara användbar för korrelativ, funktionell och mekanistisk analys av EV i biologiska, fysiologiska och patologiska studier.

Introduction

Extracellulära vesiklar (EV) har föreslagits för att definiera cellfrisatta lipid-dubbelskikt-slutna extracellulära strukturer1, som spelar viktiga roller i olika fysiologiska och patologiska händelser2. EV som frigörs av friska celler kan grovt delas in i två huvudkategorier, nämligen exosomer (eller små EV) bildade genom en intracellulär endocytisk handelsväg3 och mikrovesiklar (eller stora EV) som utvecklas genom den yttre spirande plasmamembranet i cellen4. Medan många studier fokuserar på funktionen hos EV som samlats in från odlade celler in vitro5, är EV som härrör från cirkulationen eller vävnaderna mer komplexa och heterogena, vilket har fördelen att återspegla organismens verkliga tillstånd in vivo6. Dessutom kan nästan alla typer av vävnader producera EV in vivo , och dessa EV kan fungera som budbärare i vävnaden eller överföras av olika kroppsvätskor, särskilt perifert blod, för att underlätta systemisk kommunikation7. EV i cirkulationen och vävnaderna är också mål för sjukdomsdiagnos och behandling8.

Medan exosomer har studerats intensivt under de senaste åren har mikrovesiklar också viktiga biologiska funktioner, som lätt kan extraheras utan ultracentrifugering, vilket främjar grundforskning och klinisk forskning9. En kritisk fråga när det gäller elfordon isolerade från cirkulationen och vävnaderna är att de härrör från olika celltyper10. Eftersom mikrovesiklar blåses från plasmamembranet och presenteras av ett överflöd av cellytemolekyler9, är det möjligt att använda modercellmembranmarkörer för att identifiera det cellulära ursprunget för dessa EV. Specifikt kan flödescytometri (FC) -tekniken tillämpas för att detektera membranmarkörer. Dessutom kan forskare isolera elfordonen och göra ytterligare analyser baserat på de funktionella lasterna.

Detta protokoll tillhandahåller en grundlig procedur för att extrahera och karakterisera EV från in vivo-prover. EV: erna isoleras via differentiell centrifugering, och karakteriseringen av EV inkluderar morfologisk identifiering via nanopartikelspårningsanalys (NTA) och transmissionselektronmikroskopi (TEM), ursprungsanalys via FC och proteinlastanalys via western blot. Blodplasma och maxillärben hos möss används som representanter. Forskare kan hänvisa till detta protokoll för elbilar från andra källor och göra motsvarande ändringar.

Protocol

Djurförsöken utfördes i enlighet med riktlinjerna för institutionell djurvård och användningskommitté vid fjärde militära medicinska universitetet och ARRIVE-riktlinjerna. För den aktuella studien användes 8 veckor gamla C57Bl/6-möss (ingen preferens för varken honor eller hanar). Stegen för att isolera EV i plasma och vävnad illustreras i figur 1. Plasman tas som en representant för att beskriva EV-isoleringsproceduren från kroppsvätskor. Maxillärbenet tas som en represen…

Representative Results

Enligt det experimentella arbetsflödet kan EV extraheras från perifert blod och fasta vävnader (figur 1). Maxillärbenet hos en mus i åldern 8 veckor är ungefär 0,1 ± 0,05 g och cirka 300 μL plasma kan samlas in från musen. Efter protokollstegen kan 0,3 mg respektive 3 μg EV samlas in. Som analyserats av TEM och NTA är de typiska morfologiska egenskaperna hos EV runda koppformade membranvesiklar med en diameter som sträcker sig från 50-300 nm (figur 2</stron…

Discussion

När man studerar elfordonens egenskaper, öde och funktion är det viktigt att isolera elbilar med hög avkastning och låg förorening. Olika metoder finns för att extrahera EV, såsom densitetsgradientcentrifugering (DGC), storleksuteslutningskromatografi (SEC) och immunocapture analyser 4,20. Här användes en av de vanligaste metoderna, differentialcentrifugering; Fördelarna med detta är att det inte är tidskrävande, det genererar ett högt utbyte av EV…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation of China (32000974, 81870796, 82170988 och 81930025) och China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 och BX20190380). Vi är tacksamma för hjälp från National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU).

Materials

4% paraformaldehyde  Biosharp 143174 Transmission electron microscope
Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody Yeason 34306ES60 Flow cytometry
Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody Invitrogen A11008 Flow cytometry
Anti-CD18 antibody Abcam ab131044 Flow cytometry
Anti-CD81 antibody Abcam ab109201 Western blot
anti-CD9 antibody Huabio ET1601-9 Western blot
Anti-Mitofilin antibody Abcam ab110329 Western blot
APOA1 Rabbit pAb Abclone A14211 Western blot
BCA protein assay kit TIANGEN PA115 Western blot
BLUeye Prestained Protein Ladder Sigma-Aldrich 94964-500UL Western blot
Bovine serum albumin MP Biomedical 218072801 Western blot
Caveolin-1 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-53564 Western blot
CellMask Orange plasma membrane stain Invitrogen C10045 Flow cytometry
Chemiluminescence Amersham Biosciences N/A Western blot
Curved operating scissor JZ Surgical Instrument J21040 EV isolation
Electronic balance Zhi Ke ZK-DST EV isolation
Epoch spectrophotometer BioTek N/A Western blot
Eppendorf tubes Eppendorf 3810X EV isolation
Flotillin-1 antibody PTM BIO PTM-5369 Western blot
Gel imaging system Tanon 4600 Western blot
Golgin84 Novus nbp1-83352 Western blot
Grids – Formvar/Carbon Coated – Copper 200 mesh Polysciences 24915 Transmission electron microscope
Heparin Solution StemCell  7980 EV isolation
Liberase Research Grade Sigma-Aldrich 5401127001 EV isolation
Microscopic tweezer JZ Surgical Instrument JD1020 EV isolation
NovoCyte flow cytometer ACEA N/A Flow cytometry
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells Epizyme LK206 Western blot
OSCAR(D-19) antibody Santa Cruz Biotechnology SC-34235 Flow cytometry
PBS (2x) ZHHC PW013 Western blot
Pentobarbital sodium Sigma-Aldrich 57-33-0 Anesthetization
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jacson 115-035-003 Western blot
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jacson 111-035-003 Western blot
Phosphotungstic acid RHAWN 12501-23-4 Transmission electron microscope
PKM2(d78a4) xp rabbit  mab  Cell Signaling 4053t Western blot
Polyethylene (PE) film Xiang yi 200150055 Transmission electron microscope
Polyvinylidene fluoride membranes  Roche 3010040001 Western blot
Protease inhibitors Roche 4693132001 Western blot
Recombinant anti-PGD antibody Abcam ab129199 Western blot
RIPA lysis buffer Beyotime P0013 Western blot
SDS-PAGE loading buffer (5x) Cwbio CW0027S Western blot
Size beads Invitrogen F13839 Flow cytometry
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges Hitachi CT15E EV isolation
Transmission electron microscope HITACHI H-7650 Transmission electron microscope
Tween-20 MP Biomedicals 19472 Western blot
Vortex Mixer Genie Scientific Industries SI0425 EV isolation
ZetaView BASIC NTA – Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 Particle Metrix N/A Nanoparticle tracking analysis
α-Actinin-4 Rabbit mAb Abclone A3379 Western blot
β-actin Cwbio CW0096M Western blot
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).
  2. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  3. Van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  4. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).
  5. Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 63 (2018).
  6. Thietart, S., Rautou, P. E. Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician’s point of view. Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).
  7. Xia, W., et al. Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors. Nature Communications. 12 (1), 6043 (2021).
  8. In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T. Tumor-educated pletelets. Blood. 133 (22), 2359-2364 (2019).
  9. Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation. Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).
  10. Brahmer, A., et al. endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820 (2019).
  11. Yang, H., et al. Blood collection through subclavian vein puncture in mice. Journal of Visualized Experiments. (147), e59556 (2019).
  12. Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales. Molecular Cancer. 18 (1), 59 (2019).
  13. Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
  14. Forsyth, C. B., Mathews, H. L. Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans. Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).
  15. Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685 (2020).
  16. Welsh, J. A., et al. MIFlowCyt-EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1713526 (2020).
  17. Durcin, M., et al. Characterisation of adipocyte-derived extracellular vesicle subtypes identifies distinct protein and lipid signatures for large and small extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1305677 (2017).
  18. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
  19. Noren Hooten, N., et al. Association of extracellular vesicle protein cargo with race and clinical markers of mortality. Scientific Reports. 9 (1), 17582 (2019).
  20. Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).
  21. Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).
  22. Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  23. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  24. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).
  25. Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  26. Görgens, A., et al. Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238 (2020).
  27. Maroto, R., et al. Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478 (2017).
  28. Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).
  29. Liu, D., et al. Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors. Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).
  30. Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).
  31. Dawson, G. Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes). Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).
  32. Zhang, G., et al. Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030 (2020).
  33. Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).

Tags

Extracellular VesiclesIsolationAnalysisPlasmaSurface AntigensProtein CargoesFlow CytometryMaxillary BoneLiberaseCentrifugationPBSSample Processing
check_url/fr/63990?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Cao, Y., Qiu, J., Chen, D., Li, C., Xing, S., Zheng, C., Liu, X., Jin, Y., Sui, B. Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues. J. Vis. Exp. (188), e63990, doi:10.3791/63990 (2022).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image