Detta protokoll beskriver en metod för att extrahera extracellulära vesiklar från perifert blod och fast vävnad med efterföljande profilering av ytantigener och proteinlaster.
Cirkulerande och vävnadsresidenta extracellulära vesiklar (EV) representerar lovande mål som nya teranostiska biomarkörer, och de framträder som viktiga aktörer i upprätthållandet av organismhomeostas och utvecklingen av ett brett spektrum av sjukdomar. Medan den aktuella forskningen fokuserar på karakterisering av endogena exosomer med endosomalt ursprung, har mikrovesiklar som blåser från plasmamembranet fått ökad uppmärksamhet vid hälsa och sjukdom, som presenteras av ett överflöd av ytmolekyler som rekapitulerar membransignaturen hos moderceller. Här presenteras en reproducerbar procedur baserad på differentiell centrifugering för att extrahera och karakterisera EV från plasma och fasta vävnader, såsom benet. Protokollet beskriver vidare efterföljande profilering av ytantigener och proteinlaster av EV, som därmed är spårbara för sina härledningar och identifierade med komponenter relaterade till potentiell funktion. Denna metod kommer att vara användbar för korrelativ, funktionell och mekanistisk analys av EV i biologiska, fysiologiska och patologiska studier.
Extracellulära vesiklar (EV) har föreslagits för att definiera cellfrisatta lipid-dubbelskikt-slutna extracellulära strukturer1, som spelar viktiga roller i olika fysiologiska och patologiska händelser2. EV som frigörs av friska celler kan grovt delas in i två huvudkategorier, nämligen exosomer (eller små EV) bildade genom en intracellulär endocytisk handelsväg3 och mikrovesiklar (eller stora EV) som utvecklas genom den yttre spirande plasmamembranet i cellen4. Medan många studier fokuserar på funktionen hos EV som samlats in från odlade celler in vitro5, är EV som härrör från cirkulationen eller vävnaderna mer komplexa och heterogena, vilket har fördelen att återspegla organismens verkliga tillstånd in vivo6. Dessutom kan nästan alla typer av vävnader producera EV in vivo , och dessa EV kan fungera som budbärare i vävnaden eller överföras av olika kroppsvätskor, särskilt perifert blod, för att underlätta systemisk kommunikation7. EV i cirkulationen och vävnaderna är också mål för sjukdomsdiagnos och behandling8.
Medan exosomer har studerats intensivt under de senaste åren har mikrovesiklar också viktiga biologiska funktioner, som lätt kan extraheras utan ultracentrifugering, vilket främjar grundforskning och klinisk forskning9. En kritisk fråga när det gäller elfordon isolerade från cirkulationen och vävnaderna är att de härrör från olika celltyper10. Eftersom mikrovesiklar blåses från plasmamembranet och presenteras av ett överflöd av cellytemolekyler9, är det möjligt att använda modercellmembranmarkörer för att identifiera det cellulära ursprunget för dessa EV. Specifikt kan flödescytometri (FC) -tekniken tillämpas för att detektera membranmarkörer. Dessutom kan forskare isolera elfordonen och göra ytterligare analyser baserat på de funktionella lasterna.
Detta protokoll tillhandahåller en grundlig procedur för att extrahera och karakterisera EV från in vivo-prover. EV: erna isoleras via differentiell centrifugering, och karakteriseringen av EV inkluderar morfologisk identifiering via nanopartikelspårningsanalys (NTA) och transmissionselektronmikroskopi (TEM), ursprungsanalys via FC och proteinlastanalys via western blot. Blodplasma och maxillärben hos möss används som representanter. Forskare kan hänvisa till detta protokoll för elbilar från andra källor och göra motsvarande ändringar.
När man studerar elfordonens egenskaper, öde och funktion är det viktigt att isolera elbilar med hög avkastning och låg förorening. Olika metoder finns för att extrahera EV, såsom densitetsgradientcentrifugering (DGC), storleksuteslutningskromatografi (SEC) och immunocapture analyser 4,20. Här användes en av de vanligaste metoderna, differentialcentrifugering; Fördelarna med detta är att det inte är tidskrävande, det genererar ett högt utbyte av EV…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation of China (32000974, 81870796, 82170988 och 81930025) och China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 och BX20190380). Vi är tacksamma för hjälp från National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU).
4% paraformaldehyde | Biosharp | 143174 | Transmission electron microscope |
Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody | Yeason | 34306ES60 | Flow cytometry |
Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | Flow cytometry |
Anti-CD18 antibody | Abcam | ab131044 | Flow cytometry |
Anti-CD81 antibody | Abcam | ab109201 | Western blot |
anti-CD9 antibody | Huabio | ET1601-9 | Western blot |
Anti-Mitofilin antibody | Abcam | ab110329 | Western blot |
APOA1 Rabbit pAb | Abclone | A14211 | Western blot |
BCA protein assay kit | TIANGEN | PA115 | Western blot |
BLUeye Prestained Protein Ladder | Sigma-Aldrich | 94964-500UL | Western blot |
Bovine serum albumin | MP Biomedical | 218072801 | Western blot |
Caveolin-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53564 | Western blot |
CellMask Orange plasma membrane stain | Invitrogen | C10045 | Flow cytometry |
Chemiluminescence | Amersham Biosciences | N/A | Western blot |
Curved operating scissor | JZ Surgical Instrument | J21040 | EV isolation |
Electronic balance | Zhi Ke | ZK-DST | EV isolation |
Epoch spectrophotometer | BioTek | N/A | Western blot |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 3810X | EV isolation |
Flotillin-1 antibody | PTM BIO | PTM-5369 | Western blot |
Gel imaging system | Tanon | 4600 | Western blot |
Golgin84 | Novus | nbp1-83352 | Western blot |
Grids – Formvar/Carbon Coated – Copper 200 mesh | Polysciences | 24915 | Transmission electron microscope |
Heparin Solution | StemCell | 7980 | EV isolation |
Liberase Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | EV isolation |
Microscopic tweezer | JZ Surgical Instrument | JD1020 | EV isolation |
NovoCyte flow cytometer | ACEA | N/A | Flow cytometry |
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells | Epizyme | LK206 | Western blot |
OSCAR(D-19) antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-34235 | Flow cytometry |
PBS (2x) | ZHHC | PW013 | Western blot |
Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | 57-33-0 | Anesthetization |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jacson | 115-035-003 | Western blot |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jacson | 111-035-003 | Western blot |
Phosphotungstic acid | RHAWN | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
PKM2(d78a4) xp rabbit mab | Cell Signaling | 4053t | Western blot |
Polyethylene (PE) film | Xiang yi | 200150055 | Transmission electron microscope |
Polyvinylidene fluoride membranes | Roche | 3010040001 | Western blot |
Protease inhibitors | Roche | 4693132001 | Western blot |
Recombinant anti-PGD antibody | Abcam | ab129199 | Western blot |
RIPA lysis buffer | Beyotime | P0013 | Western blot |
SDS-PAGE loading buffer (5x) | Cwbio | CW0027S | Western blot |
Size beads | Invitrogen | F13839 | Flow cytometry |
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges | Hitachi | CT15E | EV isolation |
Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650 | Transmission electron microscope |
Tween-20 | MP Biomedicals | 19472 | Western blot |
Vortex Mixer Genie | Scientific Industries | SI0425 | EV isolation |
ZetaView BASIC NTA – Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 | Particle Metrix | N/A | Nanoparticle tracking analysis |
α-Actinin-4 Rabbit mAb | Abclone | A3379 | Western blot |
β-actin | Cwbio | CW0096M | Western blot |