Denne protokol beskriver en metode til ekstraktion af ekstracellulære vesikler fra perifert blod og fast væv med efterfølgende profilering af overfladeantigener og proteinlaster.
Cirkulerende og vævsresidente ekstracellulære vesikler (EV’er) repræsenterer lovende mål som nye teranostiske biomarkører, og de fremstår som vigtige aktører i vedligeholdelsen af organismens homeostase og progressionen af et bredt spektrum af sygdomme. Mens den nuværende forskning fokuserer på karakterisering af endogene eksosomer med den endosomale oprindelse, har mikrovesikler, der blebber fra plasmamembranen, fået stigende opmærksomhed inden for sundhed og sygdom, som er kendetegnet ved en overflod af overflademolekyler, der rekapitulerer membransignaturen af moderceller. Her præsenteres en reproducerbar procedure baseret på differentiel centrifugering til ekstraktion og karakterisering af EV’er fra plasma og fast væv, såsom knoglen. Protokollen beskriver yderligere efterfølgende profilering af overfladeantigener og proteinlaster af EV’er, som således kan spores for deres afledninger og identificeres med komponenter relateret til potentiel funktion. Denne metode vil være nyttig til korrelativ, funktionel og mekanistisk analyse af EV’er i biologiske, fysiologiske og patologiske undersøgelser.
Ekstracellulære vesikler (EV’er) er blevet foreslået til at definere cellefrigivne lipid-dobbeltlag-lukkede ekstracellulære strukturer1, som spiller vigtige roller i forskellige fysiologiske og patologiske hændelser2. EV’er frigivet af raske celler kan groft opdeles i to hovedkategorier, nemlig exosomer (eller små EV’er) dannet gennem en intracellulær endocytisk traffickingvej3 og mikrovesikler (eller store EV’er) udviklet ved udadgående spirende af plasmamembranen i cellen4. Mens mange undersøgelser fokuserer på funktionen af EV’er indsamlet fra dyrkede celler in vitro5, er EV’er afledt af cirkulationen eller væv mere komplekse og heterogene, hvilket har den fordel, at de afspejler organismens sande tilstand in vivo6. Desuden kan næsten alle former for væv producere EV’er in vivo , og disse EV’er kan fungere som budbringere i vævet eller overføres af forskellige kropsvæsker, især det perifere blod, for at lette systemisk kommunikation7. Elbiler i kredsløb og væv er også mål for sygdomsdiagnose og -behandling8.
Mens exosomer er blevet intensivt undersøgt i de senere år, har mikrovesikler også vigtige biologiske funktioner, som let kan ekstraheres uden ultracentrifugering, hvilket fremmer grundlæggende og klinisk forskning9. Især er et kritisk problem vedrørende elbiler, der er isoleret fra cirkulation og væv, at de stammer fra forskellige celletyper10. Da mikrovesikler blæses fra plasmamembranen og fremhæves af en overflod af celleoverflademolekyler9, er det muligt at bruge modercellemembranmarkører til at identificere den cellulære oprindelse af disse EV’er. Specifikt kan flowcytometriteknikken (FC) anvendes til at detektere membranmarkører. Desuden kan forskerne isolere elbilerne og lave yderligere analyser baseret på de funktionelle laster.
Denne protokol giver en grundig procedure til ekstraktion og karakterisering af elbiler fra in vivo-prøver. EV’erne isoleres via differentiel centrifugering, og karakteriseringen af EV’er inkluderer morfologisk identifikation via nanopartikelsporingsanalyse (NTA) og transmissionselektronmikroskopi (TEM), oprindelsesanalyse via FC og proteinlastanalyse via western blot. Blodplasma og maksillær knogle hos mus anvendes som repræsentanter. Forskere kan henvise til denne protokol for elbiler fra andre kilder og foretage tilsvarende ændringer.
Når man studerer elbilers funktioner, skæbne og funktion, er det afgørende at isolere elbiler med højt udbytte og lav forurening. Der findes forskellige metoder til ekstraktion af elbiler, såsom densitetsgradientcentrifugering (DGC), størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) og immunocapture-assays 4,20. Her blev en af de mest almindeligt anvendte metoder, differentiel centrifugering, brugt; Fordelene ved dette er, at det ikke er tidskrævende, det generere…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (32000974, 81870796, 82170988 og 81930025) og China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 og BX20190380). Vi er taknemmelige for hjælpen fra National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU).
4% paraformaldehyde | Biosharp | 143174 | Transmission electron microscope |
Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody | Yeason | 34306ES60 | Flow cytometry |
Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | Flow cytometry |
Anti-CD18 antibody | Abcam | ab131044 | Flow cytometry |
Anti-CD81 antibody | Abcam | ab109201 | Western blot |
anti-CD9 antibody | Huabio | ET1601-9 | Western blot |
Anti-Mitofilin antibody | Abcam | ab110329 | Western blot |
APOA1 Rabbit pAb | Abclone | A14211 | Western blot |
BCA protein assay kit | TIANGEN | PA115 | Western blot |
BLUeye Prestained Protein Ladder | Sigma-Aldrich | 94964-500UL | Western blot |
Bovine serum albumin | MP Biomedical | 218072801 | Western blot |
Caveolin-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53564 | Western blot |
CellMask Orange plasma membrane stain | Invitrogen | C10045 | Flow cytometry |
Chemiluminescence | Amersham Biosciences | N/A | Western blot |
Curved operating scissor | JZ Surgical Instrument | J21040 | EV isolation |
Electronic balance | Zhi Ke | ZK-DST | EV isolation |
Epoch spectrophotometer | BioTek | N/A | Western blot |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 3810X | EV isolation |
Flotillin-1 antibody | PTM BIO | PTM-5369 | Western blot |
Gel imaging system | Tanon | 4600 | Western blot |
Golgin84 | Novus | nbp1-83352 | Western blot |
Grids – Formvar/Carbon Coated – Copper 200 mesh | Polysciences | 24915 | Transmission electron microscope |
Heparin Solution | StemCell | 7980 | EV isolation |
Liberase Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | EV isolation |
Microscopic tweezer | JZ Surgical Instrument | JD1020 | EV isolation |
NovoCyte flow cytometer | ACEA | N/A | Flow cytometry |
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells | Epizyme | LK206 | Western blot |
OSCAR(D-19) antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-34235 | Flow cytometry |
PBS (2x) | ZHHC | PW013 | Western blot |
Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | 57-33-0 | Anesthetization |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jacson | 115-035-003 | Western blot |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jacson | 111-035-003 | Western blot |
Phosphotungstic acid | RHAWN | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
PKM2(d78a4) xp rabbit mab | Cell Signaling | 4053t | Western blot |
Polyethylene (PE) film | Xiang yi | 200150055 | Transmission electron microscope |
Polyvinylidene fluoride membranes | Roche | 3010040001 | Western blot |
Protease inhibitors | Roche | 4693132001 | Western blot |
Recombinant anti-PGD antibody | Abcam | ab129199 | Western blot |
RIPA lysis buffer | Beyotime | P0013 | Western blot |
SDS-PAGE loading buffer (5x) | Cwbio | CW0027S | Western blot |
Size beads | Invitrogen | F13839 | Flow cytometry |
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges | Hitachi | CT15E | EV isolation |
Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650 | Transmission electron microscope |
Tween-20 | MP Biomedicals | 19472 | Western blot |
Vortex Mixer Genie | Scientific Industries | SI0425 | EV isolation |
ZetaView BASIC NTA – Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 | Particle Metrix | N/A | Nanoparticle tracking analysis |
α-Actinin-4 Rabbit mAb | Abclone | A3379 | Western blot |
β-actin | Cwbio | CW0096M | Western blot |