Isolering og analyse af sporbare og funktionaliserede ekstracellulære vesikler fra plasma og fast væv

Summary

Denne protokol beskriver en metode til ekstraktion af ekstracellulære vesikler fra perifert blod og fast væv med efterfølgende profilering af overfladeantigener og proteinlaster.

Abstract

Cirkulerende og vævsresidente ekstracellulære vesikler (EV’er) repræsenterer lovende mål som nye teranostiske biomarkører, og de fremstår som vigtige aktører i vedligeholdelsen af organismens homeostase og progressionen af et bredt spektrum af sygdomme. Mens den nuværende forskning fokuserer på karakterisering af endogene eksosomer med den endosomale oprindelse, har mikrovesikler, der blebber fra plasmamembranen, fået stigende opmærksomhed inden for sundhed og sygdom, som er kendetegnet ved en overflod af overflademolekyler, der rekapitulerer membransignaturen af moderceller. Her præsenteres en reproducerbar procedure baseret på differentiel centrifugering til ekstraktion og karakterisering af EV’er fra plasma og fast væv, såsom knoglen. Protokollen beskriver yderligere efterfølgende profilering af overfladeantigener og proteinlaster af EV’er, som således kan spores for deres afledninger og identificeres med komponenter relateret til potentiel funktion. Denne metode vil være nyttig til korrelativ, funktionel og mekanistisk analyse af EV’er i biologiske, fysiologiske og patologiske undersøgelser.

Introduction

Ekstracellulære vesikler (EV’er) er blevet foreslået til at definere cellefrigivne lipid-dobbeltlag-lukkede ekstracellulære strukturer¹, som spiller vigtige roller i forskellige fysiologiske og patologiske hændelser². EV’er frigivet af raske celler kan groft opdeles i to hovedkategorier, nemlig exosomer (eller små EV’er) dannet gennem en intracellulær endocytisk traffickingvej³ og mikrovesikler (eller store EV’er) udviklet ved udadgående spirende af plasmamembranen i cellen⁴. Mens mange undersøgelser fokuserer på funktionen af EV’er indsamlet fra dyrkede celler in vitro⁵, er EV’er afledt af cirkulationen eller væv mere komplekse og heterogene, hvilket har den fordel, at de afspejler organismens sande tilstand in vivo⁶. Desuden kan næsten alle former for væv producere EV’er in vivo , og disse EV’er kan fungere som budbringere i vævet eller overføres af forskellige kropsvæsker, især det perifere blod, for at lette systemisk kommunikation⁷. Elbiler i kredsløb og væv er også mål for sygdomsdiagnose og -behandling⁸.

Mens exosomer er blevet intensivt undersøgt i de senere år, har mikrovesikler også vigtige biologiske funktioner, som let kan ekstraheres uden ultracentrifugering, hvilket fremmer grundlæggende og klinisk forskning⁹. Især er et kritisk problem vedrørende elbiler, der er isoleret fra cirkulation og væv, at de stammer fra forskellige celletyper¹⁰. Da mikrovesikler blæses fra plasmamembranen og fremhæves af en overflod af celleoverflademolekyler⁹, er det muligt at bruge modercellemembranmarkører til at identificere den cellulære oprindelse af disse EV’er. Specifikt kan flowcytometriteknikken (FC) anvendes til at detektere membranmarkører. Desuden kan forskerne isolere elbilerne og lave yderligere analyser baseret på de funktionelle laster.

Denne protokol giver en grundig procedure til ekstraktion og karakterisering af elbiler fra in vivo-prøver. EV’erne isoleres via differentiel centrifugering, og karakteriseringen af EV’er inkluderer morfologisk identifikation via nanopartikelsporingsanalyse (NTA) og transmissionselektronmikroskopi (TEM), oprindelsesanalyse via FC og proteinlastanalyse via western blot. Blodplasma og maksillær knogle hos mus anvendes som repræsentanter. Forskere kan henvise til denne protokol for elbiler fra andre kilder og foretage tilsvarende ændringer.

Protocol

Dyreforsøgene blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Institutional Animal Care and Use Committee fra Fourth Military Medical University og ARRIVE-retningslinjerne. Til denne undersøgelse blev 8 uger gamle C57Bl/6-mus (ingen præference for hverken hunner eller hanner) anvendt. De trin, der er involveret i isolering af plasma- og vævs-EV’er, er illustreret i figur 1. Plasmaet tages som en repræsentant for at beskrive EV-isolationsproceduren fra kropsvæsker. Den maksill?…

Representative Results

Ifølge den eksperimentelle arbejdsgang kan EV’er ekstraheres fra perifert blod og fast væv (figur 1). Den maksillære knogle hos en mus i alderen 8 uger er ca. 0,1 ± 0,05 g, og ca. 300 μL plasma kan opsamles fra musen. Ved at følge protokoltrinnene kan der indsamles henholdsvis 0,3 mg og 3 μg elbiler. Som analyseret af TEM og NTA er de typiske morfologiske egenskaber ved EV’er runde kopformede membranvesikler med en diameter på 50-300 nm (figur 2). FC kan…

Discussion

Når man studerer elbilers funktioner, skæbne og funktion, er det afgørende at isolere elbiler med højt udbytte og lav forurening. Der findes forskellige metoder til ekstraktion af elbiler, såsom densitetsgradientcentrifugering (DGC), størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) og immunocapture-assays ^4,20. Her blev en af de mest almindeligt anvendte metoder, differentiel centrifugering, brugt; Fordelene ved dette er, at det ikke er tidskrævende, det generere…

Materials

4% paraformaldehyde	Biosharp	143174	Transmission electron microscope
Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody	Yeason	34306ES60	Flow cytometry
Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen	A11008	Flow cytometry
Anti-CD18 antibody	Abcam	ab131044	Flow cytometry
Anti-CD81 antibody	Abcam	ab109201	Western blot
anti-CD9 antibody	Huabio	ET1601-9	Western blot
Anti-Mitofilin antibody	Abcam	ab110329	Western blot
APOA1 Rabbit pAb	Abclone	A14211	Western blot
BCA protein assay kit	TIANGEN	PA115	Western blot
BLUeye Prestained Protein Ladder	Sigma-Aldrich	94964-500UL	Western blot
Bovine serum albumin	MP Biomedical	218072801	Western blot
Caveolin-1 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-53564	Western blot
CellMask Orange plasma membrane stain	Invitrogen	C10045	Flow cytometry
Chemiluminescence	Amersham Biosciences	N/A	Western blot
Curved operating scissor	JZ Surgical Instrument	J21040	EV isolation
Electronic balance	Zhi Ke	ZK-DST	EV isolation
Epoch spectrophotometer	BioTek	N/A	Western blot
Eppendorf tubes	Eppendorf	3810X	EV isolation
Flotillin-1 antibody	PTM BIO	PTM-5369	Western blot
Gel imaging system	Tanon	4600	Western blot
Golgin84	Novus	nbp1-83352	Western blot
Grids – Formvar/Carbon Coated – Copper 200 mesh	Polysciences	24915	Transmission electron microscope
Heparin Solution	StemCell	7980	EV isolation
Liberase Research Grade	Sigma-Aldrich	5401127001	EV isolation
Microscopic tweezer	JZ Surgical Instrument	JD1020	EV isolation
NovoCyte flow cytometer	ACEA	N/A	Flow cytometry
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells	Epizyme	LK206	Western blot
OSCAR(D-19) antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-34235	Flow cytometry
PBS (2x)	ZHHC	PW013	Western blot
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	57-33-0	Anesthetization
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jacson	115-035-003	Western blot
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jacson	111-035-003	Western blot
Phosphotungstic acid	RHAWN	12501-23-4	Transmission electron microscope
PKM2(d78a4) xp rabbit  mab	Cell Signaling	4053t	Western blot
Polyethylene (PE) film	Xiang yi	200150055	Transmission electron microscope
Polyvinylidene fluoride membranes	Roche	3010040001	Western blot
Protease inhibitors	Roche	4693132001	Western blot
Recombinant anti-PGD antibody	Abcam	ab129199	Western blot
RIPA lysis buffer	Beyotime	P0013	Western blot
SDS-PAGE loading buffer (5x)	Cwbio	CW0027S	Western blot
Size beads	Invitrogen	F13839	Flow cytometry
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges	Hitachi	CT15E	EV isolation
Transmission electron microscope	HITACHI	H-7650	Transmission electron microscope
Tween-20	MP Biomedicals	19472	Western blot
Vortex Mixer Genie	Scientific Industries	SI0425	EV isolation
ZetaView BASIC NTA – Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120	Particle Metrix	N/A	Nanoparticle tracking analysis
α-Actinin-4 Rabbit mAb	Abclone	A3379	Western blot
β-actin	Cwbio	CW0096M	Western blot