Isolering og analyse av sporbare og funksjonaliserte ekstracellulære vesikler fra plasma og fast vev

Summary

Denne protokollen beskriver en metode for å ekstrahere ekstracellulære vesikler fra perifert blod og fast vev med påfølgende profilering av overflateantigener og proteinlaster.

Abstract

Sirkulerende og vevsresidente ekstracellulære vesikler (EV) representerer lovende mål som nye teranostiske biomarkører, og de fremstår som viktige aktører i opprettholdelsen av organisatorisk homeostase og utviklingen av et bredt spekter av sykdommer. Mens den nåværende forskningen fokuserer på karakterisering av endogene eksosomer med endosomal opprinnelse, har mikrovesikler som blebber fra plasmamembranen fått økende oppmerksomhet i helse og sykdom, som er preget av en overflod av overflatemolekyler som rekapitulerer membransignaturen til foreldreceller. Her presenteres en reproduserbar prosedyre basert på differensiell sentrifugering for ekstrahering og karakterisering av EV fra plasma og fast vev, slik som beinet. Protokollen beskriver videre etterfølgende profilering av overflateantigener og proteinlaster av elbiler, som dermed er sporbare for deres derivasjoner og identifisert med komponenter relatert til potensiell funksjon. Denne metoden vil være nyttig for korrelativ, funksjonell og mekanistisk analyse av elbiler i biologiske, fysiologiske og patologiske studier.

Introduction

Ekstracellulære vesikler (EV) har blitt foreslått for å definere cellefrigjorte lipid-dobbeltlags lukkede ekstracellulære strukturer¹, som spiller viktige roller i ulike fysiologiske og patologiske hendelser². EV frigjort av friske celler kan grovt deles inn i to hovedkategorier, nemlig eksosomer (eller små EV) dannet gjennom en intracellulær endocytisk trafikkvei³ og mikrovesikler (eller store EV) utviklet av den utadvendte spiringen av plasmamembranen til cellen⁴. Mens mange studier fokuserer på funksjonen til EV samlet fra dyrkede celler in vitro⁵, er EV avledet fra sirkulasjonen eller vevet mer komplekse og heterogene, som har fordelen av å reflektere den sanne tilstanden til organismen in vivo⁶. Videre kan nesten alle typer vev produsere EV in vivo , og disse EVene kan fungere som budbringere i vevet eller overføres av forskjellige kroppsvæsker, spesielt perifert blod, for å lette systemisk kommunikasjon⁷. Elbiler i sirkulasjon og vev er også mål for sykdomsdiagnose og behandling⁸.

Mens eksosomer har blitt intensivt studert de siste årene, har mikrovesikler også viktige biologiske funksjoner, som lett kan ekstraheres uten ultrasentrifugering, og dermed fremme grunnleggende og klinisk forskning⁹. Spesielt er et kritisk problem med elbiler isolert fra sirkulasjon og vev at de er avledet fra forskjellige celletyper¹⁰. Siden mikrovesikler blåses fra plasmamembranen og kjennetegnes av en overflod av celleoverflatemolekyler⁹, er det mulig å bruke foreldrecellemembranmarkører for å identifisere den cellulære opprinnelsen til disse EVene. Spesielt kan flowcytometri (FC) -teknikken brukes til å oppdage membranmarkører. Dessuten kan forskerne isolere elbilene og gjøre ytterligere analyser basert på de funksjonelle lastene.

Den nåværende protokollen gir en grundig prosedyre for å trekke ut og karakterisere elbiler fra in vivo-prøver. Elbilene er isolert via differensialsentrifugering, og karakteriseringen av elbiler inkluderer morfologisk identifikasjon via nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) og transmisjonselektronmikroskopi (TEM), opprinnelsesanalyse via FC og proteinfraktanalyse via western blot. Blodplasmaet og maksillærbenet av mus brukes som representanter. Forskere kan referere til denne protokollen for elbiler fra andre kilder og gjøre tilsvarende modifikasjoner.

Protocol

Dyreforsøkene ble utført i samsvar med retningslinjene for institusjonell dyrepleie- og brukskomité ved det fjerde militære medisinske universitetet og ARRIVE-retningslinjene. For denne studien ble 8 uker gamle C57Bl / 6 mus (ingen preferanse for verken kvinner eller menn) brukt. Trinnene som er involvert i å isolere plasma- og vevs-EVer er illustrert i figur 1. Plasmaet er tatt som en representant for å beskrive EV-isolasjonsprosedyren fra kroppsvæsker. Det maksillære beinet er tatt…

Representative Results

Ifølge den eksperimentelle arbeidsflyten kan elbiler ekstraheres fra perifert blod og fast vev (figur 1). Det maksillære beinet til en mus i alderen 8 uker er ca. 0,1 ± 0,05 g, og ca. 300 μl plasma kan samles fra musen. Etter protokolltrinnene kan henholdsvis 0,3 mg og 3 μg elbiler samles inn. Som analysert av TEM og NTA, er de typiske morfologiske egenskapene til EV runde koppformede membranvesikler med en diameter fra 50-300 nm (figur 2). FC kan detektere…

Discussion

Når man studerer funksjonene, skjebnen og funksjonen til elbiler, er det avgjørende å isolere elbiler med høy avkastning og lav forurensning. Det finnes ulike metoder for å trekke ut EV, for eksempel tetthetsgradientsentrifugering (DGC), størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) og immunfangstanalyser ^4,20. Her ble en av de mest brukte metodene, differensialsentrifugering, brukt; Fordelene med dette er at det ikke er tidkrevende, det genererer et høyt utby…

Materials

4% paraformaldehyde	Biosharp	143174	Transmission electron microscope
Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody	Yeason	34306ES60	Flow cytometry
Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen	A11008	Flow cytometry
Anti-CD18 antibody	Abcam	ab131044	Flow cytometry
Anti-CD81 antibody	Abcam	ab109201	Western blot
anti-CD9 antibody	Huabio	ET1601-9	Western blot
Anti-Mitofilin antibody	Abcam	ab110329	Western blot
APOA1 Rabbit pAb	Abclone	A14211	Western blot
BCA protein assay kit	TIANGEN	PA115	Western blot
BLUeye Prestained Protein Ladder	Sigma-Aldrich	94964-500UL	Western blot
Bovine serum albumin	MP Biomedical	218072801	Western blot
Caveolin-1 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-53564	Western blot
CellMask Orange plasma membrane stain	Invitrogen	C10045	Flow cytometry
Chemiluminescence	Amersham Biosciences	N/A	Western blot
Curved operating scissor	JZ Surgical Instrument	J21040	EV isolation
Electronic balance	Zhi Ke	ZK-DST	EV isolation
Epoch spectrophotometer	BioTek	N/A	Western blot
Eppendorf tubes	Eppendorf	3810X	EV isolation
Flotillin-1 antibody	PTM BIO	PTM-5369	Western blot
Gel imaging system	Tanon	4600	Western blot
Golgin84	Novus	nbp1-83352	Western blot
Grids – Formvar/Carbon Coated – Copper 200 mesh	Polysciences	24915	Transmission electron microscope
Heparin Solution	StemCell	7980	EV isolation
Liberase Research Grade	Sigma-Aldrich	5401127001	EV isolation
Microscopic tweezer	JZ Surgical Instrument	JD1020	EV isolation
NovoCyte flow cytometer	ACEA	N/A	Flow cytometry
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells	Epizyme	LK206	Western blot
OSCAR(D-19) antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-34235	Flow cytometry
PBS (2x)	ZHHC	PW013	Western blot
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	57-33-0	Anesthetization
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jacson	115-035-003	Western blot
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jacson	111-035-003	Western blot
Phosphotungstic acid	RHAWN	12501-23-4	Transmission electron microscope
PKM2(d78a4) xp rabbit  mab	Cell Signaling	4053t	Western blot
Polyethylene (PE) film	Xiang yi	200150055	Transmission electron microscope
Polyvinylidene fluoride membranes	Roche	3010040001	Western blot
Protease inhibitors	Roche	4693132001	Western blot
Recombinant anti-PGD antibody	Abcam	ab129199	Western blot
RIPA lysis buffer	Beyotime	P0013	Western blot
SDS-PAGE loading buffer (5x)	Cwbio	CW0027S	Western blot
Size beads	Invitrogen	F13839	Flow cytometry
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges	Hitachi	CT15E	EV isolation
Transmission electron microscope	HITACHI	H-7650	Transmission electron microscope
Tween-20	MP Biomedicals	19472	Western blot
Vortex Mixer Genie	Scientific Industries	SI0425	EV isolation
ZetaView BASIC NTA – Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120	Particle Metrix	N/A	Nanoparticle tracking analysis
α-Actinin-4 Rabbit mAb	Abclone	A3379	Western blot
β-actin	Cwbio	CW0096M	Western blot