JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

Plazma ve Solid Dokulardan İzlenebilir ve İşlevselleştirilmiş Hücre Dışı Veziküllerin İzlenmesi ve Analizi

Published: October 17, 2022
doi:
10.3791/63990
, , , , , , , ,
1State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology,The Fourth Military Medical University, 2Department of Orthodontics, School of Stomatology,The Fourth Military Medical University, 3Department of VIP Dental Care, School of Stomatology,The Fourth Military Medical University, 4School of Basic Medicine,The Fourth Military Medical University, 5College of Life Science,Northwest University, 6Xi’an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine

Summary

Bu protokol, periferik kan ve katı dokulardan hücre dışı veziküllerin çıkarılması ve daha sonra yüzey antijenlerinin ve protein kargolarının profillenmesi için bir yöntem tanımlamaktadır.

Abstract

Dolaşımdaki ve dokuda yerleşik hücre dışı veziküller (EV’ler) yeni teranostik biyobelirteçler olarak umut verici hedefleri temsil eder ve organizma homeostazının korunmasında ve geniş bir hastalık spektrumunun ilerlemesinde önemli oyuncular olarak ortaya çıkarlar. Mevcut araştırma, endozomal kökenli endojen eksozomların karakterizasyonuna odaklanırken, plazma zarından dökülen mikro-parçacıklar, ana hücrelerin zar imzasını özetleyen yüzey moleküllerinin bolluğu ile öne çıkan sağlık ve hastalıkta artan bir dikkat kazanmıştır. Burada, EV’leri plazmadan ve kemik gibi katı dokulardan çıkarmak ve karakterize etmek için diferansiyel santrifüjlemeye dayanan tekrarlanabilir bir prosedür sunulmaktadır. Protokol ayrıca, yüzey antijenlerinin ve EV’lerin protein yüklerinin daha sonraki profillemelerini açıklamaktadır, bu nedenle türevleri için izlenebilir ve potansiyel fonksiyonla ilgili bileşenlerle tanımlanmıştır. Bu yöntem, biyolojik, fizyolojik ve patolojik çalışmalarda EV’lerin korelasyonlu, fonksiyonel ve mekanik analizi için yararlı olacaktır.

Introduction

Hücre dışı veziküllerin (EV’ler), çeşitli fizyolojik ve patolojik olaylarda önemli rol oynayan hücre dışı yapılarıtanımlamak için hücre dışı veziküller (EV’ler) önerilmiştir2. Sağlıklı hücreler tarafından salınan EV’ler genel olarak iki ana kategoriye ayrılabilir: hücre içi endositik trafik yolu3 yoluyla oluşan eksozomlar (veya küçük EV’ler) ve hücre4’ün plazma zarının dışa doğru tomurcuklanmasıyla gelişen mikro-parçacıklar (veya büyük EV’ler). Birçok çalışma, in vitro5 kültürlü hücrelerden toplanan EV’lerin işlevine odaklanırken, dolaşımdan veya dokulardan türetilen EV’ler, organizmanın gerçek durumunu in vivo6’da yansıtma avantajına sahip olan daha karmaşık ve heterojendir. Ayrıca, hemen hemen her türlü doku in vivo EV’ler üretebilir ve bu EV’ler doku içinde haberci olarak hareket edebilir veya sistemik iletişimi kolaylaştırmak için çeşitli vücut sıvıları, özellikle periferik kan tarafından aktarılabilir7. Dolaşımdaki EV’ler ve dokular da hastalık tanı ve tedavisi için hedeflerdir8.

Eksozomlar son yıllarda yoğun bir şekilde çalışılırken, mikro-parçacıklar ayrıca ultrasantrifüjleme olmadan kolayca ekstrakte edilebilen önemli biyolojik fonksiyonlara sahiptir, böylece temel ve klinik araştırmaları teşvik eder9. Özellikle, dolaşımdan ve dokulardan izole edilen EV’lerle ilgili kritik bir konu, farklı hücre tiplerinden türetilmiş olmalarıdır10. Mikro-parçacıklar plazma zarından kesildiğinden ve bol miktarda hücre yüzey molekülü9 ile öne çıktığından, bu EV’lerin hücresel kökenini tanımlamak için ana hücre zarı belirteçlerinin kullanılması mümkündür. Spesifik olarak, membran belirteçlerini tespit etmek için akış sitometrisi (FC) tekniği uygulanabilir. Dahası, araştırmacılar EV’leri izole edebilir ve fonksiyonel kargolara dayanarak daha fazla analiz yapabilirler.

Mevcut protokol, EV’leri in vivo örneklerden çıkarmak ve karakterize etmek için kapsamlı bir prosedür sunmaktadır. EV’ler diferansiyel santrifüjleme yoluyla izole edilir ve EV’lerin karakterizasyonu, nanopartikül izleme analizi (NTA) ve iletim elektron mikroskobu (TEM) yoluyla morfolojik tanımlamayı, FC yoluyla orijin analizini ve batı lekesi yoluyla protein kargo analizini içerir. Farelerin kan plazması ve maksiller kemiği temsilci olarak kullanılır. Araştırmacılar, diğer kaynaklardan EV’ler için bu protokole başvurabilir ve ilgili değişiklikleri yapabilirler.

Protocol

Hayvan deneyleri, Dördüncü Askeri Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Kılavuzları ve ARRIVE kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma için 8 haftalık C57Bl / 6 fareleri (dişi veya erkek tercihi olmadan) kullanılmıştır. Plazma ve doku EV’lerinin izole edilmesinde yer alan adımlar Şekil 1’de gösterilmiştir. Plazma, vücut sıvılarından EV izolasyon prosedürünü tanımlamak için bir temsilci olarak alınır. Maksille…

Representative Results

Deneysel iş akışına göre, EV’ler periferik kan ve katı dokulardan çıkarılabilir (Şekil 1). 8 haftalık bir farenin maksiller kemiği yaklaşık 0.1 ± 0.05 g’dır ve fareden yaklaşık 300 μL plazma toplanabilir. Protokol adımlarını takiben, sırasıyla 0.3 mg ve 3 μg EV toplanabilir. TEM ve NTA ile analiz edildiği gibi, EV’lerin tipik morfolojik özellikleri, çapı 50-300 nm arasında değişen yuvarlak fincan şeklindeki membran vezikülleridir (Şekil…

Discussion

EV’lerin özelliklerini, kaderini ve işlevini incelerken, EV’leri yüksek verim ve düşük kontaminasyonla izole etmek çok önemlidir. EV’leri çıkarmak için yoğunluk gradyanı santrifüjleme (DGC), boyut dışlama kromatografisi (SEC) ve immünoyakalama testleri 4,20 gibi çeşitli yöntemler mevcuttur. Burada en sık kullanılan yöntemlerden biri olan diferansiyel santrifüjleme kullanılmıştır; Bunun avantajları, zaman alıcı olmaması, sınırlı …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32000974, 81870796, 82170988 ve 81930025) ve Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2019M663986 ve BX20190380) tarafından desteklenmiştir. Temel Tıp Ulusal Deneysel Öğretim Gösteri Merkezi’nin (AMFU) yardımı için minnettarız.

Materials

4% paraformaldehyde  Biosharp 143174 Transmission electron microscope
Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody Yeason 34306ES60 Flow cytometry
Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody Invitrogen A11008 Flow cytometry
Anti-CD18 antibody Abcam ab131044 Flow cytometry
Anti-CD81 antibody Abcam ab109201 Western blot
anti-CD9 antibody Huabio ET1601-9 Western blot
Anti-Mitofilin antibody Abcam ab110329 Western blot
APOA1 Rabbit pAb Abclone A14211 Western blot
BCA protein assay kit TIANGEN PA115 Western blot
BLUeye Prestained Protein Ladder Sigma-Aldrich 94964-500UL Western blot
Bovine serum albumin MP Biomedical 218072801 Western blot
Caveolin-1 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-53564 Western blot
CellMask Orange plasma membrane stain Invitrogen C10045 Flow cytometry
Chemiluminescence Amersham Biosciences N/A Western blot
Curved operating scissor JZ Surgical Instrument J21040 EV isolation
Electronic balance Zhi Ke ZK-DST EV isolation
Epoch spectrophotometer BioTek N/A Western blot
Eppendorf tubes Eppendorf 3810X EV isolation
Flotillin-1 antibody PTM BIO PTM-5369 Western blot
Gel imaging system Tanon 4600 Western blot
Golgin84 Novus nbp1-83352 Western blot
Grids – Formvar/Carbon Coated – Copper 200 mesh Polysciences 24915 Transmission electron microscope
Heparin Solution StemCell  7980 EV isolation
Liberase Research Grade Sigma-Aldrich 5401127001 EV isolation
Microscopic tweezer JZ Surgical Instrument JD1020 EV isolation
NovoCyte flow cytometer ACEA N/A Flow cytometry
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells Epizyme LK206 Western blot
OSCAR(D-19) antibody Santa Cruz Biotechnology SC-34235 Flow cytometry
PBS (2x) ZHHC PW013 Western blot
Pentobarbital sodium Sigma-Aldrich 57-33-0 Anesthetization
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jacson 115-035-003 Western blot
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jacson 111-035-003 Western blot
Phosphotungstic acid RHAWN 12501-23-4 Transmission electron microscope
PKM2(d78a4) xp rabbit  mab  Cell Signaling 4053t Western blot
Polyethylene (PE) film Xiang yi 200150055 Transmission electron microscope
Polyvinylidene fluoride membranes  Roche 3010040001 Western blot
Protease inhibitors Roche 4693132001 Western blot
Recombinant anti-PGD antibody Abcam ab129199 Western blot
RIPA lysis buffer Beyotime P0013 Western blot
SDS-PAGE loading buffer (5x) Cwbio CW0027S Western blot
Size beads Invitrogen F13839 Flow cytometry
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges Hitachi CT15E EV isolation
Transmission electron microscope HITACHI H-7650 Transmission electron microscope
Tween-20 MP Biomedicals 19472 Western blot
Vortex Mixer Genie Scientific Industries SI0425 EV isolation
ZetaView BASIC NTA – Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 Particle Metrix N/A Nanoparticle tracking analysis
α-Actinin-4 Rabbit mAb Abclone A3379 Western blot
β-actin Cwbio CW0096M Western blot
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).
  2. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  3. Van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  4. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).
  5. Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 63 (2018).
  6. Thietart, S., Rautou, P. E. Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician’s point of view. Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).
  7. Xia, W., et al. Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors. Nature Communications. 12 (1), 6043 (2021).
  8. In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T. Tumor-educated pletelets. Blood. 133 (22), 2359-2364 (2019).
  9. Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation. Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).
  10. Brahmer, A., et al. endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820 (2019).
  11. Yang, H., et al. Blood collection through subclavian vein puncture in mice. Journal of Visualized Experiments. (147), e59556 (2019).
  12. Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales. Molecular Cancer. 18 (1), 59 (2019).
  13. Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
  14. Forsyth, C. B., Mathews, H. L. Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans. Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).
  15. Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685 (2020).
  16. Welsh, J. A., et al. MIFlowCyt-EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1713526 (2020).
  17. Durcin, M., et al. Characterisation of adipocyte-derived extracellular vesicle subtypes identifies distinct protein and lipid signatures for large and small extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1305677 (2017).
  18. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
  19. Noren Hooten, N., et al. Association of extracellular vesicle protein cargo with race and clinical markers of mortality. Scientific Reports. 9 (1), 17582 (2019).
  20. Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).
  21. Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).
  22. Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  23. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  24. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).
  25. Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  26. Görgens, A., et al. Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238 (2020).
  27. Maroto, R., et al. Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478 (2017).
  28. Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).
  29. Liu, D., et al. Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors. Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).
  30. Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).
  31. Dawson, G. Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes). Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).
  32. Zhang, G., et al. Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030 (2020).
  33. Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).

Tags

Extracellular VesiclesIsolationAnalysisPlasmaSurface AntigensProtein CargoesFlow CytometryMaxillary BoneLiberaseCentrifugationPBSSample Processing
check_url/fr/63990?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Cao, Y., Qiu, J., Chen, D., Li, C., Xing, S., Zheng, C., Liu, X., Jin, Y., Sui, B. Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues. J. Vis. Exp. (188), e63990, doi:10.3791/63990 (2022).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image