En veiledning for å undersøke intramuskulær fettdannelse og dens cellulære opprinnelse i skjelettmuskulatur

Summary

Erstatning av sunt muskelvev med intramuskulært fett er et fremtredende trekk ved menneskelige sykdommer og tilstander. Denne protokollen skisserer hvordan man visualiserer, avbilder og kvantifiserer intramuskulært fett, slik at man kan studere mekanismene som ligger til grunn for intramuskulær fettdannelse.

Abstract

Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) er mesenkymale stromale celler som spiller en avgjørende rolle under skjelettmuskulaturhomeostase og regenerering. FAPs bygger og vedlikeholder den ekstracellulære matrisen som fungerer som et molekylært myofiber stillas. I tillegg er FAPs uunnværlige for myofiberregenerering, da de utskiller en rekke gunstige faktorer som registreres av muskelstamceller (MuSC). I syke tilstander er FAPs imidlertid den cellulære opprinnelsen til intramuskulært fett og fibrotisk arrvev. Denne fettfibrosen er et kjennetegn på sarkopeni og nevromuskulære sykdommer, som Duchenne muskeldystrofi. En betydelig barriere for å bestemme hvorfor og hvordan FAPs differensierer i intramuskulært fett er effektiv bevaring og påfølgende visualisering av adipocytter, spesielt i frosne vevsseksjoner. Konvensjonelle metoder for behandling av skjelettmuskulaturvev, for eksempel snap-frysing, bevarer ikke morfologien til individuelle adipocytter på riktig måte, og forhindrer dermed nøyaktig visualisering og kvantifisering. For å overvinne denne hindringen ble det utviklet en streng protokoll som bevarer adipocyttmorfologi i skjelettmuskelseksjoner som tillater visualisering, avbildning og kvantifisering av intramuskulært fett. Protokollen skisserer også hvordan man behandler en del av muskelvev for RT-qPCR, slik at brukerne kan bekrefte observerte endringer i fettdannelse ved å se forskjeller i uttrykket av adipogene gener. I tillegg kan den tilpasses for å visualisere adipocytter ved helmontert immunfluorescens av muskelprøver. Til slutt skisserer denne protokollen hvordan man utfører genetisk avstamningssporing av Pdgfrα-uttrykkende FAPs for å studere den adipogene konverteringen av FAPs. Denne protokollen gir konsekvent høyoppløselige og morfologisk nøyaktige immunfluorescerende bilder av adipocytter, sammen med bekreftelse av RT-qPCR, noe som muliggjør robust, streng og reproduserbar visualisering og kvantifisering av intramuskulært fett. Sammen er analyserørledningen beskrevet her det første skrittet for å forbedre vår forståelse av hvordan FAPs skiller seg ut i intramuskulært fett, og gir et rammeverk for å validere nye inngrep for å forhindre fettdannelse.

Introduction

Infiltrasjon av sunt muskelvev med fettfibrose er et fremtredende trekk ved Duchenne muskeldystrofi (DMD) og andre nevromuskulære sykdommer, samt sarkopeni, fedme og diabetes 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Selv om økt fettinfiltrasjon under disse forholdene er sterkt forbundet med redusert muskelfunksjon, er vår kunnskap om hvorfor og hvordan intramuskulære fettformer fortsatt er begrenset. FAPs er en multipotent mesenkymal stromal cellepopulasjon tilstede i de fleste voksne organer, inkludert skjelettmuskulatur^11,12. Med alderen og i kroniske sykdommer produserer FAPs imidlertid fibrotisk arrvev og skiller seg ut i adipocytter, som ligger mellom individuelle myofibre og danner intramuskulært fett 13,14,15,16,17,18,19,20.

For å begynne å bekjempe intramuskulær fettdannelse, må mekanismene for hvordan FAPs blir til adipocytter defineres. PDGFRα er “gullstandard” -markøren i feltet for å identifisere FAPs i muskelen til flere arter 13,16,17,18,20,21,22,23,24,25,26,27. Som et resultat har flere murine tamoxifen-induserbare Cre-linjer, under kontroll av Pdgfrα-promotoren, blitt generert, noe som muliggjør genetisk manipulerende FAPs in vivo ved bruk av Cre-LoxP-systemet 27,28,29. For eksempel, ved å kombinere denne induserbare Cre-linjen med en genetisk reporter, kan avstamningssporing av FAPs utføres, en strategi vi med hell har brukt på skjebnekart FAPs i muskel og hvitt fettvev^20,30. Foruten avstamningssporing, gir disse Cre-linjene verdifulle verktøy for å studere FAP-til-fett-konvertering.

Et stort hinder for å definere mekanismen for den adipogene omdannelsen av FAPs til intramuskulært fett er evnen til å strengt og reproduserbart kvantifisere mengden intramuskulært fett som har dannet seg under forskjellige forhold. Nøkkelen er å balansere bevaring av muskel- og fettvev og matche dette med de tilgjengelige fargemetodene for å visualisere adipocytter. For eksempel er skjelettmuskulatur ofte snapfrosset uten forutgående fiksering, noe som bevarer myofibre, men forstyrrer adipocyttmorfologien (figur 1). I motsetning til dette fjerner fiksering etterfulgt av parafininnbygging, mens du viser den beste vevshistologien, inkludert adipocytter, alle lipider, og gjør dermed de fleste lipofile fargestoffer, som det ofte brukte fargestoffet Oil Red O, ubrukelig.

Figur 1: Representative bilder av intramuskulært fett i snap-frozen versus fixed muscle tissue. (A) Skjematisk oversikt over eksperimentoppsettet. Immunfluorescerende bilder som viser adipocytter (gul), myofibre (grå) og kjerner (cyan) innenfor både (B) snapfrosne og (C) faste TAer 21 dager etter glyserolskade. Skalafelt: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protokollen beskrevet her bevarer myofiber- og adipocyttmorfologi og tillater visualisering og analyse av flere celletyper. Denne tilnærmingen er basert på immunfluorescensfarging av adipocytter i paraformaldehyd (PFA) -fast muskelvev, noe som muliggjør samfarging med flere antistoffer. Det kan også enkelt tilpasses for å romlig vise intramuskulært fett i intakt vev ved hjelp av helmontert avbildning, og dermed gi informasjon om det cellulære mikromiljøet av fett i muskelen. I tillegg kan denne protokollen kombineres med vår nylig publiserte tilnærming for å bestemme tverrsnittsarealet av myofibre i fast muskelvev³¹, en viktig måling for å vurdere muskelhelsen. Kombinere denne tilnærmingen med genetisk avstamningssporing for å skjebnekartlegge differensieringen av FAPs i adipocytter er også skissert her. Dermed muliggjør den allsidige protokollen beskrevet her streng og reproduserbar vurdering av FAPs og deres differensiering i intramuskulært fett i vevsseksjoner og intakt vev.

Figur 2: Skjematisk protokolloversikt. Skjematisk oversikt over vevsbehandling der en tredjedel av TA fjernes, snapfrosses og homogeniseres for påfølgende RNA-isolasjon og transkripsjonsanalyse via RT-qPCR. De andre to tredjedelene av TA er PFA-fast og behandlet for immunostaining på frosne seksjoner eller helmonterte fibre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

Alle dyreprotokoller ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Florida. 1. Genetisk avstamningssporing av FAPs MERK: Hvis genetisk avstamningssporing av FAPs ikke er ønsket, kan trinn 1 hoppes over. For å utføre avstamningssporing av FAPer, få de nødvendige musealllene.MERK: Flere tamoxifen-induserbare Cre-linjer, under kontroll av Pdgfrα-promotoren , har blitt generert for å lykkes med å målrette FAPs, inkludert fra Hogan29, Rando27 og Bergles32 laboratorier. Som genetisk reporter av Cre-aktivitet er mange Rosa26-reporteralleler tilgjengelige som Rosa26EYFP33. Mens det foreslås for hvert laboratorium å bestemme hvilken Cre-Reporter-kombinasjon som er mest effektiv, ved å krysse PdgfrαCreERT2 mus (29 og Jax # 032770) til Rosa26EYFP (33 og Jax # 006148) reporter, den resulterende PdgfrαCreERT2; Rosa26EYFPmus kan brukes til å effektivt og spesifikt merke FAPs20. For å spore skjebnen til modne FAPs, anbefales det å vente til musene har nådd minst ~ 10 uker før de administrerer tamoxifen. Avstamningssporingseksperimenter kan utføres på både menn og kvinner. Tamoxifen administrasjon gjennom oral gavaging Forbered 40 mg / ml tamoxifen i maisolje og vortex godt for å blande 1 dag før gavaging. Inkuber O/N ved 37 °C i en roterende hybridiseringsovn.FORSIKTIG: Tamoxifen er kreftfremkallende og bør håndteres forsiktig. Bruk alltid hansker ved håndtering og bruk en maske når du veier den som et pulver, da det er fare for innånding. Rengjør området i henhold til protokollen og fest en gavaging nål til en 1 ml sprøyte. Trekk 200 μL tamoxifen inn i sprøyten. Scruff PdgfrαCreERT2 ; Rosa26EYFP mus (10 uker gamle; begge kjønn brukt) ved å plassere dem på en flat overflate og fast grep bunnen av halen. Bruk en ledig hånd til å ta tak i midten av musen med tommelen og pekefingeren, og skyv grepet forsiktig og svakt til like forbi skuldrene. Klyp huden tilbake med tommelen og pekefingeren, ta opp musen og vend hånden slik at musen vender mot brukeren, og stikk halen mellom lillefingeren og ringfingeren på hånden som holder musen. På dette tidspunktet må du sørge for at musen er godt immobilisert og ikke i stand til å bevege hodet eller armene. Sett gavaging nålen inn i munnen og bruk den til å vippe hodet på musen litt tilbake; Dette gjør at spiserøret blir bedre tilgjengelig. Sett forsiktig og sakte nålen inn i spiserøret. Ikke tving kanylen hvis det oppstår motstand. nålen skal gli lett ned. Injiser sakte tamoxifen. Overvåk musene i 15-20 minutter for å sikre at det ikke oppstår problemer under gavaging.MERK: Administrasjon av tamoxifen på 2 påfølgende dager resulterer vanligvis i ~ 75% -85% rekombinasjonseffektivitet av FAPs uten å forårsake noen bivirkninger. Det anbefales at brukeren venter i 1-2 uker før han fremkaller skade, noe som gjør at gjenværende tamoxifen kan fjernes fra systemet og eventuelt gjenværende protein kan vendes. 2. Skade på tibialis fremre (TA) muskel MERK: For å studere intramuskulært fett anbefales det å bruke en glyserolbasert skademodell (50% glyserol i steril saltvann), noe som resulterer i massiv intramuskulær fettdannelse 34,35,36,37. Forbered bedøvelsesmaskinen ved å tilsette isofluran og sørg for at rørene til både musekammeret og nesekjeglen er åpne. Rengjør kammeret og arbeidsområdet med enten 70% etanol eller peroksidoppløsning (avhengig av protokoller). Still oksygenstrømningshastigheten til 2,5 l/min og isoflurankonsentrasjonen til 2,5 %. Plasser en mus i anestesikammeret og vent ~ 5 minutter på at den skal bedøves. Plasser musen liggende på en ren varmepute og sett nesen inn i nesekjeglen. Påfør forsiktig vet oftalmisk salve på øynene med en bomullstuppet applikator for å forhindre tørrhet mens du er under anestesi. Overvåk anestesi kontinuerlig og utfør en tåklemme på musen før skaden for å sikre at musen er fullstendig bedøvet. Rengjør benet som skal injiseres med en ny spritkompress for å desinfisere. Trekk opp 30-50 μL 50% glyserol (avhengig av musens størrelse) i insulinsprøyten. Børst forsiktig opp håret på leggen for å avsløre plasseringen av TA.MERK: Det er lettere å bevege håret og oppnå bedre visualisering når det fortsatt er vått fra alkoholservietten. Etter å ha lokalisert TA (bare lateral til tibia, stikker den litt ut gjennom huden og kan føles med mild palpasjon), sett nålen inn i TA distalt, nær ankelen. Sett nålen helt inn i muskelen og injiser glyserol sakte mens du gradvis trekker nålen, noe som bidrar til å skade det meste av muskelen.NOTAT: Det er best å sette nålen parallelt med beinet, med bare en litt forhøyet vinkel. En god skade forårsaker vanligvis dorsiflexion da TA trekker seg sammen etter at nålen er trukket ut. Hvis musens tær spredte seg, er det sannsynlig at muskelen extensor digitorum longus (EDL) ble injisert. Plasser musen tilbake i buret og overvåke i ca 15-20 min for å sikre anestesi utvinning. Kast kanylen i en beholder for skarpe gjenstander. Sett aldri hetten på en nål igjen.MERK: Analgesi etter glyserol injeksjon skal gis som godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee. Adipocytter kan observeres så snart som 5 dager etter skade (dpi). Ved 7 dpi har alle adipocytter dannet seg, og med 21 dpi har de fullstendig modnet. 3. Vev høsting Forbered 4% PFA i 1x PBS og legg på is før du starter høsting. Plasser eventuelle plater (12- eller 24-brønner) som brukes til muskelfiksering på is og tilsett 4% PFA til hver brønn, og sørg for at hver brønn har 10-20 ganger mer volum PFA enn vevet som festes. Mellom 7 og 21 dager etter glyserolskade, avliv musen i henhold til institusjonelle retningslinjer (dvs. overdosering av isofluran etterfulgt av cervikal dislokasjon). Begynn å høste vev som skal brukes til histologi eller RNA-isolasjon.MERK: Vev bør hurtigfryses eller plasseres i PFA innen 10-15 minutter etter ofring (figur 2). Spray liberalt noen områder av musen som skal kuttes inn med 70% etanol for å holde håret av dissekere området og instrumenter. Saks til å klippe huden rundt toppen av benet, nær bekkenet (figur 3A). Trekk huden på benet forsiktig fra toppen og ned til ankelen (figur 3B).MERK: TA er en dråpeformet muskel med en klart definert distal sene festet til den mediale kileskriften og det første metatarsale beinet. Det er lateralt til tibia og strekker seg opp til det nedre kneet. Fjern først det ytre bindevevslaget (epimysium) ved hjelp av skarpspisset pinsett før høsting av TA (figur 3C). Bruk et dissekeringsmikroskop for å visualisere epimysiumet bedre. Skyv pinsetten under TA fra bunnen av muskelen, start ved distale sener, og trekk forsiktig oppover mot kneet (figur 3D). Stopp på slutten av muskelen; ikke skyv forbi motstanden som føltes i det nedre kneet. Hvis det er betydelig motstand før du når det nedre kneet, stopp og fortsett å fjerne rester av bindevev.MERK: Det er en annen distal sene like lateral til TA-senen som festes til EDL, som er en slank muskel lateral til TA. Å være forsiktig med å bare skyve pinsetten under TA-senen forhindrer utilsiktet høsting av EDL, men den kan også enkelt fjernes etter fiksering. Når TA er delvis løftet fra beinet med pinsetten, bruk samme bevegelse med en skalpell for å kutte forbindelsen mellom TA og underknekt (figur 3E). Klipp senen ved ankelen med saks for å fjerne TA helt. Håndter bare muskelen ved senen for å unngå å skade fibrene. Skjær 1/3 av TA i enden overfor senen (figur 3F), legg den i et mikrosentrifugerør og frys ned ved å slippe den ned i flytende nitrogen (figur 3H). Senk den andre 2/3 av vevet i en merket brønn med 4% PFA for histologi (figur 3I). Sørg for å holde styr på når det første og siste vevet ble plassert i fikseringsmiddel. Plasser på en shaker i 2-2,5 timer ved 4 °C. Varigheten av fiksering er avhengig av vevet og dets størrelse. Bestem varigheten som kreves for å fikse vevet. Fiksering av TAer i 2-2,5 timer ved 4 ° C bevarer vanligvis adipocyttmorfologi godt uten å forårsake overfiksering av vevet.MERK: Hvis du planlegger å bruke TA til helmontert immunfluorescerende farging, hopp over resten av denne protokollen til du når seksjon 7: “Hele mount immunfluorescerende farging”. Etter fiksering, fjern PFA fra brønnene, skyll vevet med kaldt 1x PBS 2-3 ganger, og vask deretter 2-3 ganger med kaldt 1x PBS i 5 minutter per vask. Fjern PBS fra brønnene og tilsett nok 30% sukrose i 1x PBS for å la vevet flyte. Sett på shakeren ved 4 °C over natten. Figur 3: Tissue harvest summary. (A) Huden er kuttet ved foten av beinet og (B) bakre lemmer muskler er eksponert. (C) Når epimysiumet er fjernet fra TA, brukes (D) tang til delvis å skille muskelen og sikre at epimysiumet er fjernet helt. (E) TA kuttes fra beinet med en skalpell og fjernes etter å ha kuttet senen. (G) Etter å ha kuttet TA i en tredjedel og en to tredjedels stykke, (H) blir en tredjedel snap-frosset i flytende nitrogen for RT-qPCR-analyse og (I) de andre to tredjedelene er løst i 4% PFA for histologi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 4. Innebygging Forbered prøveformene som skal brukes til innebygging ved merking og fylling med nok innebyggingsmedium til å senke vevet helt. Fjern vev fra brønnene, tørk av overflødig sukrose på et papirhåndkle, og flytt til de frysende mediumfylte prøveformene.MERK: Det er nyttig å vite i hvilken retning formen med være seksjonert på cryostat. På denne måten kan brukeren orientere vevet i formen på en måte som gjør at interesseområdet er lett tilgjengelig. For TA vil dette oppnås ved å sette den tykkeste enden (motsatt fra senesiden) mot overflaten som skal seksjoneres. Dette gjør at TA lett kan seksjoneres på sin tykkeste del (mage) og tillater tverrsnittsskjæring av muskelfibrene. Forbered en isopentanoppslemming ved delvis å senke en beholder som inneholder isopentan i flytende nitrogen. Sørg for at det er nok flytende isopentan i beholderen til å senke omtrent halvparten av prøveformen som skal brukes til å legge inn vevet. Begynn å fryse formene ved å legge dem forsiktig i isopentanoppslemmingen og sørge for at omtrent halvparten av formen er nedsenket. Sørg også for at formen fryser likt fra alle fire sider. Ta formen ut av isopentanen like før hele formen er synlig frosset over fra toppen. Hvor lang tid dette tar, avhenger av formene som brukes. Oppbevar de frosne formene i en beholder med tørris mens du fryser resten av blokkene, og oppbevar dem deretter ved -80 °C.MERK: Isopentan for frysing kan gjenbrukes. Sett i en glassflaske, men ikke stram lokket før isopentan når romtemperatur (RT). Ellers kan trykkendringen knuse flasken. 5. Seksjonering Sett kryostat til -22 til -24 °C, tilsett former som inneholder TAer i kryostat, og vent i minst 30 minutter for temperaturakklimatisering. I mellomtiden merker du en serie positivt ladede mikroskoplysbilder. Sett inn en antirullplate og juster til kryostat slik at det er minimale hakk i platen der den kommer i kontakt med prøveblokken. Sikker på plass. Sett inn et nytt kryostatblad i bladholderen og fest det på plass.FORSIKTIG: Bladet er skarpt. Dekk bladet når du manipulerer andre deler av kryostat eller frosne former. Fjern den frosne blokken fra formen. Legg et jevnt lag med innebyggingsmedium til kryostat chucken og plasser blokken i mediet. La det sitte i 1-3 minutter til det innebygde mediet er helt frosset (ugjennomsiktig hvitt).MERK: For TAer skal det tykkeste området (magen) være synlig når du er på chucken. Plasser cryostat chuck med vevsblokken inn i kryostat. Avdekk bladet og skyv kryostat fremover til du bare kommer i kontakt med bladet. Seksjon gjennom blokken ved 25 μm seksjoner til vevet ikke lenger er skjult av det innebygde mediet.MERK: Under seksjonering justerer du vinkelen på kryostat og/eller posisjonen til scenen slik at seksjonene har jevn tykkelse. Det kan være nyttig å samle noen seksjoner for å sikre ensartethet i seksjonstykkelsen. Det anbefales at brukeren finner riktig anti-roll plate posisjon før seksjonering gjennom til området av interesse innenfor TA (magen), da dette tillater brukeren å prøve flere posisjoner av anti-roll plate til seksjonene kommer av rett uten å kaste bort vev. Endre seksjonstykkelse til 10-12 μm og samle seksjonene på merkede mikroskopglass. Seriell seksjonering anbefales ved å samle tilstøtende seksjoner på 6-10 lysbilder (merket 1-x), noe som gir mulighet for farging for flere markører. Bruk om nødvendig en tynn børste til å uncurl seksjoner før du samler dem på lysbildet.MERK: Hvis seksjonene krøller seg, må du kontrollere at temperaturen holder seg stabil innenfor området -22 til -24 °C. Hvis det er vertikale striper i seksjoner, kan dette skyldes et hakk i antirullplaten eller bladet; Dette kan fikses ved å justere posisjonen til antirullplaten og/eller bytte til et nytt blad. Etter å ha samlet tilstøtende seksjoner av samme snittplan på hvert lysbilde, juster tykkelsen tilbake til 25 μm for å gå 150-200 μm gjennom blokken, juster deretter tykkelsen tilbake til 10-12 μm og begynn å seksjonere igjen.MERK: Denne serielle inndelingen lar brukeren visualisere, avbilde og kvantifisere på forskjellige dybder gjennom TA; tre til fire seriedeler per lysbilde er tilstrekkelig. Oppbevar lysbildene og vevsblokkene ved -80 °C. 6. Immunfluorescerende (IF) farging av vevsseksjoner MERK: Siden antistoffkonsentrasjoner kan variere mellom partier og produsenter, anbefales optimalisering ved å evaluere flere forskjellige konsentrasjoner av antistoffene på testglass før farging av lysbildene av interesse. Tine/tørkes enten ved RT eller på en varm tallerken ved 37 °C i 10-20 min. Bruk en hydrofob penn til å tegne en linje på kanten av lysbildets papiroverflate, der den møter glasset. Legg lysbildene i en Coplin-krukke og vask med 1x PBS + 0,1% Tween20 (PBST) 3-5x på en shaker i minst 5 minutter per vask for å rehydrere vevsseksjonene.MERK: På dette tidspunktet er det viktig å ikke la lysbildene sitte uten å være nedsenket i PBST (opp til den hydrofobe linjen), ellers vil vevseksjonene tørke ut. Plasser lysbildene på stativet til et fuktingskammer og legg lysbildene over med 310-350 μL blokkeringsløsning (5% eselserum og 0,3% Triton X-100 i 1x PBS) i 1-2 timer ved RT.MERK: Ingen ekstra permeabiliseringstrinn er nødvendig, da blokkeringsoppløsningen inneholder 0,3 % Triton X-100, noe som muliggjør tilstrekkelig permeabilisering av vevsseksjonene. Ved bruk av primære antistoffer avledet fra mus (dvs. PAX7 og MYOD1 oppført nedenfor), anbefales det å inkludere et muse-på-mus-blokkeringstrinn ved hjelp av Fab-fragmenter (1:50) i blokkeringsløsningen for blokkeringstrinnet. Dette vil bidra til å redusere bakgrunn på grunn av uspesifikk binding av musens sekundære antistoff mot andre antistoffer enn det primære. Fortynn de primære antistoffene som skal brukes i blokkeringsløsningen kort tid før du går videre til neste trinn som følger: Primære antistoffer mot adipocyttfarging og helsnittsavbildning: Fortynnet antiperilipinkanin ved et fortynningsforhold på 1:1000. Primære antistoffer for avstamningssporing av adipocytter: Fortynnet kylling anti-GFP i forholdet 1:1000 og kanin anti-Perilipin ved 1:1000. Primære antistoffer for avstamningssporing av FAPs: Fortynnet kylling anti-GFP i forholdet 1:1000 og geit anti-PDGFRα ved 1:250. Primære antistoffer mot myogene markører: Fortynn anti-PAX7-mus i forholdet 1:25 eller museanti-MYOD1 ved 1:250, og kanin anti-LAMININ ved 1:1000.MERK: Mens antistoffene nevnt ovenfor har blitt vurdert med denne protokollen, er det sannsynlig at andre markører og antistoffer for å merke FAPs, adipocytter og / eller andre celletyper også er kompatible med denne protokollen. Det anbefales sterkt ved bruk av primære antistoffer for første gang at brukeren inkluderer et negativt kontrollglass, der primære antistoffer utelates. Dette vil kontrollere for spesifisiteten til antistoffene. Alle andre trinn i protokollen følges, inkludert tilsetning av sekundære antistoffer, men blokkeringsløsningen brukes alene i neste trinn i stedet for det primære antistoffet i blokkeringsløsningen. Dump blokkeringsløsningen av lysbildene og overlegg med 310-350 μL blokkeringsløsning med primære antistoffer og inkuber over natten ved 4 °C i fuktingskammeret. Neste dag dumper du blokkeringsløsningen/primærantistoffene fra lysbildene og legger dem i en Coplin-krukke. Skyll lysbildene 2-3 ganger med PBST og vask 3-5x med PBST på en shaker i minst 5 minutter per vask. Under den siste vasken, klargjør de sekundære antistoffene eller eventuelle direkte konjugater som skal brukes i blokkeringsløsningen. Minimer tiden disse antistoffene bruker i lyset for å unngå fotobleking. Fortynne sekundære antistoffer /direkte konjugater: 488 nm esel anti-kylling (1:1000) eller anti-kanin (1:1000) eller anti-mus (1:1000), 568 nm esel anti-geit (1:1000) eller anti-kanin (1:1000) eller Phalloidin (myofiber; 1:100), DAPI flekk (kjerner; 1:500). Legg lysbildene over 310-350 μL av blokkeringsløsningen med sekundære antistoffer og/eller direkte konjugater i fuktingskammeret. Inkubere på RT i 1-2 timer. Beskytt prøver mot lys fra nå av. Dump blokkeringsløsningen/sekundære antistoffer og legg dem i en Coplin-krukke. Skyll med PBST én gang og vask 3-5x med PBST på en shaker i minst 5 minutter per vask. Hold Coplin-krukken dekket for å forhindre lyseksponering. Tørk lysbildene så godt som mulig ved å tappe kantene og tørke ryggen mot et papirhåndkle, men ikke la vevseksjonene tørke ut. Tilsett tre eller fire dråper vandig monteringsmedium til den øverste horisontale kanten av lysbildet og legg forsiktig til et omslag. Ikke trykk ned eller beveg deg hvis det dannes luftbobler under dyna. ethvert trykk eller bevegelse kan forvride den skjøre cellulære arkitekturen til adipocytter. La monteringsmediet stille seg inn i mørket over natten før avbildning. 7. Helmontert immunfluorescerende farging Etter ~1 time fiksering (se trinn 3.14), bruk skarpspisset pinsett for å skrelle bort myofibre fra den faste TA-en. Plasser de separerte fibrene i en 24-brønns plate og vask 3x i 3 minutter hver med PBST. For alle påfølgende inkubasjoner, sørg for å legge til lokket for å forhindre fordampning. Inkuber i 1 time i 1% Triton X-100 i 1x PBS ved RT (200-300 μL) på en shaker for å tillate bedre penetrasjon av antistoffer. Etter skylling et par ganger med PBST, legg over med blokkeringsløsning (200-300 μL) og blokker på en mutter eller shaker over natten ved 4 °C. Fortynn de primære antistoffene ved ønsket konsentrasjon (dobling av konsentrasjonen har en tendens til å være et godt utgangspunkt) i blokkeringsløsningen. Inkuber prøvene (200-300 μL) på en mutter eller shaker over natten ved 4 °C. Vask prøvene grundig med PBST gjennom dagen med hyppige endringer ved RT på shakeren, ca 4-6x i 30-60 min hver vask. Fortynn de sekundære antistoffene i blokkeringsløsningen ved ønsket konsentrasjon (1:500 har en tendens til å fungere godt) pluss nukleær farging og inkuber prøvene (200-300 μL) på en mutter eller shaker over natten ved 4 °C. Vask prøvene grundig med PBST gjennom dagen med hyppige endringer ved RT på shakeren, omtrent 4-6x ganger i 30-60 minutter hver vask eller vask over natten ved 4 ° C. For å montere, tørk forsiktig av overflødig PBST og legg deretter fibrene i en eller to dråper monteringsmedium på et glassglass (figur 4A). For å heve dekslippen (18 mm x 18 mm), legg til små leireføtter; Dette vil forhindre at fibrene blir klemt sammen og feste dekslene til lysbildet. Modelleringsforbindelser fungerer bra for dette. Når dekslene er festet, legg til mer medium til kanten til området under dekslippen er fullt.MERK: I stedet for å bruke et monteringsmedium som inneholder anti-fading midler, kan vevet også flyttes gjennom en stigende serie glyserol (30% til 80% glyserol i PBS). Vent i 1-2 dager før avbildning for å tillate herding av monteringsmedium. 8. Avbildning av intramuskulært fett Slå på mikroskopet og start bildebehandlingsprogramvaren. Fest lysbildet på scenen.MERK: For avbildning av adipocytter i muskelseksjoner er et 5x eller 10x mål kombinert med bredfeltsmikroskopi ofte tilstrekkelig. For visualisering av WM-IF er det nødvendig med et konfokalt mikroskop. Bruk en hvilken som helst kanal til å identifisere området som skal avbildes. I bildebehandlingsprogramvaren justerer du forsterkning og eksponeringstid for hver kanal. Ta bilder av hele vevet i hver kanal (automatisk eller manuell i henhold til mikroskop og programvare som brukes) og slå sammen individuelle fliser for å lage en sammensetning av hele TA-tverrsnittet.MERK: Det anbefales å ta bilder av to eller tre forskjellige deler av samme TA på forskjellige dybder. Ved å kvantifisere adipocytter i hver seksjon og deretter rapportere gjennomsnittet, vil lokaliserte forskjeller i mengden intramuskulært fett på grunn av for eksempel injeksjonsfeil unngås. 9. Kvantifisering av adipocytter Hvis den ikke er installert tidligere, legger du til Cell Counter-plugin-modulen i ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). Importer bildene til ImageJ som TIF-filer eller originale mikroskopfiler. Vis hver kanal i ImageJ som en egen TIF-fil.MERK: Hvis du bruker LIF eller lignende mikroskopfiltyper, velger du Hyperstack for Vis stabel med under Importalternativer for bioformater og merker av for Delte kanaler. Klikk OK for å åpne filen. Sørg også for at autoskaleringsboksen ikke er merket av. Kontroller at bildene for hver kanal er i 8-biters format (og grått): Bilde > Type > 8-biters. Slå sammen BILDER av DAPI (blå), GFP (grønn), PERILIPIN (rød) og PHALLOIDIN (grå): Bilde > Farge > Slå sammen kanaler. Kontroller at skalaen (Analyze > Set Scale) er i mikron. Bruk frihåndsmerkingsverktøyet til å skissere den skadde og ubesudlede delen av hvert tverrsnitt, og deretter måle (Analyser > mål) og registrere det skadede vs. ubesudlede området i et regneark.MERK: Skadet muskel kan identifiseres som områder uten myofiber eller områder befolket av myofibre som inneholder sentralt plasserte kjerner. Start Cell Counter: Plugins > CellCounter > Initialize. Velg en tellertype, og tell deretter hver adipocytt. Registrer totalt antall adipocytter i et regneark, og beregn deretter antall adipocytter per 1 mm2 av det skadede området. 10. Adipogenic genuttrykk analyse ved hjelp av RT-qPCR RNA-isolasjon Før du begynner, forvarm RNasefritt vann til 45 °C og tilbered fersk 70 % EtOH (350 μL per prøve). Tilsett 1000 μL guanidiumtiocyanat til hvert rør som inneholder prøven (se trinn 3.12). Det er viktig at perle beater-godkjente rør blir brukt.FORSIKTIG: Guanidiumtiocyanat er giftig. Bruk egnet personlig verneutstyr og håndtak i en avtrekksvifte. Legg til tre mellomstore perler eller en stor og en liten perle til hvert rør. Homogeniser vevet ved 50 Hz i 2-4 minutter ved hjelp av en perleslager. Avhengig av vevstype og prøvestørrelse kan det ta opptil 10 minutter. Tilsett 200 μL kloroform.FORSIKTIG: Kloroform er giftig. Bruk personlig verneutstyr og håndtak i en avtrekksvifte. Rist prøvene i 15 s. Inkuber i 2-3 min på RT. Sentrifuge i 15 minutter ved 12 000 x g. Pipetter ut 350 μL av den klare supernatanten (øvre lag som inneholder RNA) og legg til et nytt mikrosentrifugerør som inneholder 350 μL 70% etanol. Vær forsiktig så du ikke aspirerer de nedre protein- og / eller DNA-lagene Overfør opptil 700 μL av blandingen til en minispinnkolonne plassert i et 2 ml oppsamlingsrør. Fortsett med RNA-isolasjon etter produsentens instruksjoner. Eluer med 30-50 μL RNasefritt vann, avhengig av forventet utbytte. Hold RNA på is og mål utbyttet ved hjelp av et spektrofotometer. Oppbevar RNA ved -80 °CMERK: Det er mulig å utelate DNase-behandlingstrinnet, da det er tilstrekkelig å ta av bare de øvre 350 μL av RNA-laget for å forhindre DNA-forurensning. I tillegg til RT-qPCR-analyse kan det isolerte RNA også brukes til RNA-sekvensering, i så fall anbefales et DNase-behandlingstrinn. cDNA-syntese Bruk opptil 1 μg RNA for å syntetisere cDNA med et cDNA-syntesesett, etter produsentens instruksjoner. Etter at løpet er fullført, tilsett 80 μL RNase-fritt vann. Oppbevar prøvene ved -20 °C. RT-qPCR av adipocytt-selektive gener. Bruk et 384-brønns format, tilsett 1 μL primer (~ 1 μM endelig konsentrasjon) til bunnen av hver brønn. Fortørking av primere resulterer i strammere tekniske replikasjoner. La det stå til primerne har fordampet helt (platen kan plasseres på en varmeblokk satt til 37 °C for raskere fordampning). Sett opp prøvereaksjoner med fire til åtte tekniske replikasjoner som følger: 2,5 μL fargebasert RT-PCR masterblanding, 2,1 μL RNasefritt vann og 0,4 μL cDNA (~ 1 ng) med 5 μL totalt volum per brønn. Følgende termiske syklusforhold ble brukt: denaturering ved 95 °C i 15 s og gløding/forlengelse ved 60 °C i 25 s i 40 sykluser. Normaliser rå CT -verdier (syklusterskel) til husholdningsgener (dvs. Hprt og Pde12) nivåer ved å beregne ΔΔCT som beskrevet her38. Se20 for primersekvenser.MERK: Standard praksis for RT-qPCR-analyse bør følges, for eksempel bruk av en minus revers transkripsjonskontroll (-RT), PCR-reaksjon og primervalidering.

Representative Results

Immunfluorescerende visualisering av intramuskulært fettEtter trinnene ovenfor og visning av figur 1A ble TA-vevsseksjoner samlet fra en 21-dagers postglyserolskade som enten ble snap-frosset umiddelbart etter høsting i LN2-avkjølt isopentan eller ble festet i 4% PFA i 2,5 timer. Etter kryoseksjon og farging av begge prøvene ble det tatt bilder midt på magen, det største området i TA. PERILIPIN+ adipocytter fra de ufikserte TAene (figur 1B) har signifikant endret morfologi sammenlignet med faste seksjoner (figur 1C), noe som gjør identifisering, visualisering og påfølgende kvantifisering mye vanskeligere og potensielt unøyaktig. Merk at de første PERILIPIN+ lipiddråpene ble påvist rundt 5 dager etter skade, og de fleste adipocytter ble dannet innen dag 7. 21 dager etter skade var adipocytter fullstendig modnet. Siden mengden fett per TA sterkt korrelerer med alvorlighetsgraden av den induserte skaden, må TAene bli skadet betydelig for effektivt å observere og studere intramuskulær fettdannelse. Øvelse av injeksjoner med blekk i-TAer er en fin måte å forbedre skadegraden på. Vellykkede skader har en tendens til å være over 50% av muskelen. Å merke seg, skadede områder av muskelen representerer områder uten muskelfibre eller områder som er befolket av muskelfibre som inneholder minst en sentralt plassert kjerne, et kjent kjennetegn på en regenererende muskelfiber. Denne protokollen kan lett tilpasses til flekker for FAPs og fett i 3D. For dette ble flere myofibre fra TA-fiksering nøye separert, etterfulgt av helmontert immunfluorescens. Nøkkelen er å feste fibrene riktig til glassglasset og samtidig unngå overkompresjon av vevet. Ved å bruke formbare leirføtter kan brukeren justere den nødvendige tykkelsen og feste dekslippen til lysbildet, til og med tillate bruk av et omvendt mikroskop (figur 4A). Denne metoden ble brukt med hell for å merke PDGFRα + FAPs, Phalloidin + myofibre og PERILIPIN-uttrykkende adipocytter (figur 4B, supplerende video 1 og tilleggsvideo 2). Etter å ha tatt bilder på flere z-plan som spenner opp til 150 μm i tykkelse, ble 3D-gjengivelsesmodulen i mikroskopprogramvaren brukt til å lage en 3D-rekonstruksjon. Figur 4: Helmontert immunfluorescerende farging. (A) Topp- og sidevisning av hvordan prøven monteres og legges til deksler for helmontert farging. (B) Representative 3D-rekonstruksjoner av FAPs (grønn; venstre) og adipocytter (rød; høyre) sammen med myofibre (grå) og kjerner (blå). Skalafelt: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Kvantifisering av intramuskulært fettEtter at det er tatt bilder av intramuskulært fett, ble celletellerfunksjonen i ImageJ/FIJI brukt til å telle antall PERLIPIN+- adipocytter manuelt (figur 5A). Deretter ble det totale arealet av muskelseksjonen samt det skadede området, definert av sentralt plasserte kjerner i myofibre, bestemt. For å kontrollere for skadens alvorlighetsgrad ble det totale antall adipocytter delt på det skadede området, noe som resulterte i antall fettceller per 1 mm2 skadet muskel. Vanligvis er TAer som viser <30% skade ekskludert fra kvantifiseringene. For å merke seg, selv om adipocytter er sjeldne uten skade, alt fra null til åtte per tverrsnittsareal, er det totale antall adipocytter fortsatt normalisert av totalt areal. Som fremhevet i figur 5B, forårsaker en glyserolskade massive mengder intramuskulært fett sammenlignet med en ubesudlet TA-muskel. Alternativt, siden Perilipin-fargingen er veldig ren med et høyt signal-til-støy-forhold, er det også mulig å bruke Analyze Particle-funksjonen til å bestemme det totale arealet okkupert av Perilipin. Denne metoden vil imidlertid ikke kunne skille mellom mindre vs. færre adipocytter. Opptil tre seksjoner fra minimum fire individuelle dyr ble avbildet og kvantifisert, og gjennomsnittlig antall fettceller tilstede per mus ble rapportert. Figur 5: Kvantifiseringer av intramuskulært fett. (A) Representativt bilde av hvordan man teller PERILIPIN+ adipocytter (hvite) ved hjelp av Cell Counter-funksjonen i ImageJ. Skala bar: 50 μm. (B) Hele TA-adipocyttkvantifiseringer 21 dager etter glyserolinjeksjon normalisert til 1 mm2 av det skadede området. Hver prikk representerer gjennomsnittet av en mus. Feilfelt vises som SEM. **** = p < 0,0001. (C) RNA-lag etter homogenisering og påfølgende faseseparasjon med kloroform brukes til RT-qPCR-analyse. (D) Fold endringer i ekspresjonsnivåer av Pparg og Cepbα, tidlige adipogene gener, og Plin1 og Adipoq, to modne adipocytmarkører, på forskjellige tidspunkter etter glyserolskade. Hver prikk representerer gjennomsnittet av en mus. Feilfelt vist som SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. For uavhengig å bekrefte mengden intramuskulær fett tilstede, kan genuttrykksnivåer av forskjellige adipogenic markører bestemmes. For dette kan RNA isoleres fra en del av den samme TA-muskelen som brukes til immunfluorescens (se trinn ovenfor) på forskjellige punkter etter skade. En perle beater ble brukt i kombinasjon med guanidium tiocyanat for å homogenisere vevet. Etter tilsetning av kloroform etterfulgt av sentrifugering ble det øvre RNA-holdige laget nøye ekstrahert, og minispinnkolonner ble brukt til RNA-opprydding (figur 5C). Denne metoden produserer rutinemessig høy kvalitet og kvantitet av RNA egnet for alle nedstrømsanalyser som RT-qPCR og RNAseq. For RT-qPCR ble de relative ekspresjonsnivåene av adipogene til husholdningsgener bestemt, og eventuelle relative endringer ble vurdert etter ΔΔCT-metoden38. Som beskrevet i figur 5D, sammenlignet med ubesudlet TA-muskel, induserer glyserolskade uttrykk for tidlige adipogene markører som Pparg og Cebpα så snart som 3 dager etter skade. Modne markører, som Adiponectin (Adipoq) og Perilipin (Plin1), kan oppdages så tidlig som 5 dager etter glyserolskade. Genetisk avstamningssporing av adipocytterAdipocyttfargingsprotokollen som presenteres her, kan enkelt tilpasses for å inkludere genetisk avstamningssporing av FAPs for å kartlegge og følge deres skjebne i adipocytter. Vi har for eksempel tidligere vist at rekombinasjon kan induseres via tamoxifen-administrasjon i PdgfrαCreERT2; Rosa26EYFP mus 2 uker før skaden, effektivt fjerne floxed stopp koding og uutslettelig aktivere EYFP uttrykk i FAPs (figur 6A). Vi oppnådde høy rekombinasjonseffektivitet med tamoxifen-regimet som presenteres her, med ~ 75% av PDGFRα + FAPs som uttrykker EYFP20, i likhet med hva andre laboratorier har rapportert 27,39,40. Demonstrerer at FAPs faktisk er den cellulære opprinnelsen til intramuskulært fett, har flertallet av FAPs blitt til EYFP + PERILIPIN-uttrykkende adipocytter 7 dager etter glyserolskade (figur 6B). Figur 6: Avstamningssporing av FAPs. (A) Skjematisk oversikt over det eksperimentelle oppsettet. (B) Representative immunfluorescerende bilder som viser vellykket rekombinasjon og aktivering av EYFP (gul) innenfor PDGFRα+ FAPs (rød, pilspisser) og PERILIPIN+ adipocytter (rød, stjerner). Skalafelt: 25 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Påvisning av flere celletyperDenne protokollen kan også brukes til å visualisere det myogene rommet. Ved bruk av antistoffer mot henholdsvis PAX7 og MYOD1 kan muskelstamceller (MuSC) og myoblaster lett påvises 5 dager etter glyserolskade selv i PFA-fast muskelvevssnitt (figur 7). Dermed er den presenterte protokollen allsidig og tilpasningsdyktig til ikke bare å merke og avbilde adipocytter og FAPs, men også andre celletyper av myogen avstamning. Figur 7: Muskelstamcelle og myoblast immunfluorescerende farging. (A) Skjematisk oversikt over eksperimentoppsettet. (B) Representative immunfluorescerende bilder som viser vellykket farging av muskelstamcelle (MuSC) (gul, venstre) med PAX7 og myoblaster (gul, høyre) med MYOD1. LAMININ skisserer myofibrene (hvite), og kjernene er i cyan. Skalafelt: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Supplerende video 1: 3D-gjengivelse av FAPs. Tredimensjonal rekonstruksjon av myofibre, FAPs og kjerner farget for henholdsvis PHALLOIDIN (grå), PDGFRα (grønn) og DAPI (blå), 21 dager etter skade. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen. Supplerende video 2: 3D-gjengivelse av intramuskulært fett. Volumetrisk gjengivelse av myofiberbunter (grå, PHALLOIDIN) og intramuskulært fett (rød, PERILIPIN), som har erstattet en myofiber 21 dager etter glyserolskade. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Discussion

Denne protokollen skisserer en omfattende og detaljert protokoll som muliggjør effektiv visualisering og streng kvantifisering av intramuskulært fett. Ved å dele den samme muskelen i to deler, en som brukes til immunfluorescens og den andre for RT-qPCR-analyse, er denne protokollen også svært allsidig. Det kan også kombineres med genetisk avstamningssporing av FAPs for å studere deres konvertering til adipocytter under visse forhold, og er svært tilpasningsdyktig til å merke og avbilde flere ekstra celletyper.

De mest brukte måtene å visualisere intramuskulært fett er parafinseksjoner etterfulgt av hematoksylin- og eosinfarging eller frosne seksjoner farget for lipofile fargestoffer som Oil Red O (ORO). Men mens paraffinbehandlet vev opprettholder den beste histologien, trekker den samme prosessen også ut alle lipider som forhindrer bruk av lipofile fargestoffer. Selv om lipofile fargemetoder vil fungere på både PFA-faste og ufikserte vevsseksjoner, blir lipiddråper lett forskjøvet ved å påføre trykk på dekslippen, og derved forvrenge den romlige fordelingen av intramuskulært fett. For å omgå dette etablerte en nylig studie en streng protokoll for å visualisere ORO ⁺ adipocytter ved hjelp av en helmontert tilnærming. For dette decellulariserte forfatterne TA for å visualisere den romlige fordelingen av intramuskulært fett gjennom hele TA⁴¹. Så kraftig som denne teknikken er, forhindrer den også bruk av andre co-flekker for å markere flere cellulære strukturer. Hele mount immunfluorescensmetoden som presenteres her, kan brukes til å co-farge adipocytter med en rekke markører som muliggjør fin kartlegging av det cellulære miljøet. En stor utfordring er imidlertid vevspenetrasjon av antistoffene. Jo flere fibre som holdes sammen, desto vanskeligere vil det være for antistoffene å trenge inn og binde alle tilgjengelige antigener likt. Dermed er denne metoden mest effektiv når man ser på små grupper av fibre. Samtidig er dette også en begrensning ettersom den generelle anatomiske plasseringen av intramuskulært fett går tapt når man fokuserer på bare små, avskallede fiberbunter. Men med den nåværende utviklingen av nye vevsryddingsmetoder pluss ny bildebehandlingsteknologi, vil større vevspenetrasjon og visualisering være mulig i fremtiden 42,43,44.

Mens tidligere fiksering av muskelvev bevarer adipocyttmorfologi, skaper det også en utfordring å vurdere størrelsen på myofibre, en viktig måling av muskelhelse. Myofiberstørrelse bestemmes ved å måle tverrsnittsarealet av myofibre. Vi har tidligere rapportert at tidligere fiksering av muskelvev vil føre til at de fleste markører som er tilgjengelige for å skissere myofibre, mislykkes³¹. For å overvinne denne hindringen har vi utviklet en ny bildesegmenteringsrørledning, som gjør det mulig å måle myofiberstørrelse selv i faste muskelseksjoner³¹. Dermed har vi etablert en robust og effektiv vevsbehandlingsrørledning som, kombinert med denne protokollen, overvinner de fleste ulemper forårsaket av tidligere fiksering av muskelvev.

En annen stor fordel med denne tilnærmingen er allsidighet. Ved å dele TA i to deler maksimeres mengden informasjon som kan oppnås fra en muskel. Dette reduserer ikke bare antall dyr, men legger også til et ekstra lag med kontroll ved å bekrefte histologi gjennom genuttrykk og omvendt. I tillegg kan mange forskjellige gener undersøkes utover adipogene gener. Det isolerte RNA kan også brukes til et helt muskel RNAseq-eksperiment. Til slutt kan det snapfrosne muskelstykket også brukes til proteinarbeid. En begrensning ved denne protokollen er muligheten for at skaden ikke er konsistent over hele TA-lengden. Dette kan føre til et scenario der de to muskeldelene avviker i mengden intramuskulært fett de inneholder, og kan rettferdiggjøre utelukkelse av en slik prøve fra enhver nedstrømsanalyse. Det anbefales derfor ikke bare å stole på RT-qPCR for å trekke store konklusjoner om mengden intramuskulært fett, men heller som støttende data til de histologiske kvantifiseringene.

Sammen skisserer denne protokollen en robust, effektiv og streng vevsbehandlingsrørledning som vil tillate visualisering og kvantifisering av intramuskulært fett, det første trinnet i å utvikle nye behandlingsalternativer for å bekjempe fettfibrose. Samtidig er den allsidig og kan tilpasses mange forskjellige celletyper i muskelen, så vel som adipocytter i andre vev.

Materials

16% PFA (Pack of 12, 10 mL bottles)	Electron Miscroscopy Sciences	15710
2.0 mL Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	05-408-138	microcentrifuge tubes for snapfreezing/bead beating
2-Methylbutane (4 L)	Fisher Chemical	O3551-4	isopentane
Absolute Ethanol (200 proof)	ThermoFisher Scientific	BP2818100
AffiniPure Fab fragment donkey anti-mouse	Jackson ImmunoResearch	715-007-003	mouse-on-mouse blocking
Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	703-545-155
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse secondary antibody	Invitrogen	A21202
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen	A21206
Alexa Fluor 568 donkey anti-goat secondary antibody	Invitrogen	A11057
Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen	A11037
Alexa Fluor 568 Phalloidin antibody	Invitrogen	A12380	Dissolved in 1.5 mL methanol (~66 µM working solution)
BioLite 24-well Multidishes	ThermoFisher Scientific	930186	24 well plate for PFA tissue incubation
Biometra TOne	analytikjena	8462070301	Thermal cycler
Chicken anti-GFP antibody	Aves Labs	GFP-1020
Chloroform/isoamyl alcohol 24:1(v/v) for molecular biology, DNAse, RNAse, and Protease free	ThermoFisher Scientific	AC327155000
Corn oil	Sigma Aldrich	C8267
DAPI stain	Invitrogen	D1306	150 µM working solution in dH2O
Donkey Serum (100 mL)	Millipore Sigma	5058837	for blocking solution
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	sharp-tipped tweezers
Fine Scissors Straight 9 cm	Fine Science Tools	14060-09
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01	mounting medium
Glycerol, 99.5%, for molecular biology (500 mL)	Acros Organics	327255000
Goat anti-PDGFRα antibody	R&D	AF1062
Hybridization Oven	VWR	230301V	for Tamoxifen incubation
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Vector Laboratories	H-4000	hydrophobic pen
Insulin Syringe with Micro-Fine IV needle (28 G)	BD	329461
Insulin Syringe with Slip Tip, 1 mL	BD	329654	Insulin syringe without needle, for oral gavaging
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1708890
Isoflurane	Patterson Veterinary	78938441
Leica DMi8 inverted microscope	Leica		micrscope used for widefield IF and confocal imaging
Micro Slides	VWR	48311-703	positively charged microscope slides
mouse anti-MYOD antibody	Invitrogen	MA1-41017
mouse anti-PAX7 antibody (supernatant)	DSHB	AB 428528
MX35 Premier+ Microtome blades	ThermoFisher Scientific	3052835	microtome blades
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	ND2000	spectrophotometer for RNA yield
Play-Doh	Hasbro		modeling compound
PowerUp SYBR Green Master Mix	ThermoFisher Scientific	A25742	green dye PCR master mix
Puralube Vet Ointment	Puralube	17033-211-38	vet ophthalmic ointment
QuantStudi 6 Flex Real-Time 384-well PCR System	Applied Biosystems	4485694	qPCR machine
Rabbit anti-perilipin antibody	Cell Signaling Technology	9349S
Red-Rotor Shaker	Hoefer Scientific	PR70-115V	shaker for IF staining
Richard-Allan Scientific Slip-Rite Cover Glass	ThermoFisher Scientific	152460	coverslips
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74106	contains mini spin columns
Safe-Lock Tubes 1.5 ml, natural	Eppendorf	22363204
Sample Tubes RB (2 mL)	QIAGEN	990381
Sodium azide	Alfa Aesar	14314
Stainless Steel Beads, 2.8 mm	Precellys	KT03961-1-101.BK	small beads
Stainless Steel Beads, 5 mm	QIAGEN	69989	medium beads
Stainless Steel Beads, 7 mm	QIAGEN	69990	large beads
Stainless Steel Disposable Scalpels	Miltex	327-4102	scalpel
Stainless steel feeding tube, 20 G x 38 mm, straight	Instech Laboratories	FTSS-20S-3	gavage needle
Tamoxifen	Toronto Research Chemicals	T006000
Tissue Plus O.C.T. Compound	Fisher HealthCare	4585	embedding medium
TissueLyser LT	QIAGEN	85600	bead beater
TissueLyser LT Adapter, 12-Tube	QIAGEN	69980
Tissue-Tek Cryomold	Sakura	4566	specimen molds
Triton X-100	Alfa Aesar	A16046
TRIzol Reagent	ThermoFisher Scientific	15596026	guanidium thiocyanate
Tween20 (500 mL)	Fisher BioReagents	BP337-500
VWR Micro Slides – Superfrost Plus	VWR	48311703
Wheaton Coplin staining jars	Millipore Sigma	S6016	Coplin jar