Andamios 3D macroporosos interconectados de varillas de microgel

Summary

Las varillas de microgel con grupos reactivos complementarios se producen a través de microfluídica con la capacidad de interconectarse en solución acuosa. Los microgeles anisómetros se atascan y se entrelazan en construcciones estables con poros más grandes en comparación con los sistemas de base esférica. Los microgeles modificados con GRGDS-PC forman construcciones 3D macroporosas que se pueden utilizar para el cultivo celular.

Abstract

Un sistema de dos componentes de microgeles funcionalizados de microfluídica permite una rápida interconexión en construcciones macroporosas 3D en soluciones acuosas sin aditivos adicionales. La gelificación continua fotoiniciada en chip permite la variación de la relación de aspecto del microgel, que determina las propiedades del bloque de construcción para las construcciones obtenidas. Los monómeros de metacrilato de glicidil (GMA) o metacrilato de 2-aminoetilo (AMA) se copolimerizan en la red de microgel basada en polímeros estrella de polietilenglicol (PEG) para lograr la funcionalidad epoxi o amina. Se introduce un flujo de aceite de enfoque en la estructura de salida microfluídica para garantizar la recolección continua de las varillas de microgel funcionalizadas. Según una publicación reciente, las construcciones basadas en varillas de microgel dan como resultado poros más grandes de varios cientos de micrómetros y, al mismo tiempo, conducen a una mayor estabilidad general del andamio en comparación con un modelo de base esférica. De esta manera, es posible producir construcciones de mayor volumen con más volumen libre al tiempo que se reduce la cantidad de material requerido. Los andamios macroporosos interconectados se pueden recoger y transportar sin daños ni desintegración. Los grupos amina y epoxi que no participan en la interconexión permanecen activos y pueden usarse de forma independiente para la modificación posterior. Este protocolo describe un método optimizado para la fabricación de varillas de microgel para formar andamios macroporosos interconectados que se pueden utilizar para experimentos celulares posteriores.

Introduction

Para estudiar el comportamiento celular cooperativo complejo en construcciones 3D, las plataformas de andamios deben mostrar un rendimiento consistente en reproducibilidad, tener una geometría adecuada para la migración celular y, al mismo tiempo, permitir cierta flexibilidad en términos de alteración de parámetros para investigar su influencia en el tejido vivo¹. En los últimos años, el concepto de partículas recocidas macroporosas (MAP), descrito por primera vez por Segura et al., se convirtió en una plataforma eficiente y versátil para la producción de andamios 3D². La composición personalizada de los microgeles, que son los bloques de construcción del andamio 3D final, predefine propiedades como la rigidez de la construcción, la reactividad química selectiva de la red de gel y el tamaño de poro final del andamio 2,3,4,5,6. Los péptidos adhesivos celulares como señales para las interacciones andamio-célula se incorporan a la red polimérica de los microgeles para permitir la unión celular y se pueden variar para investigar sus efectos específicos en las células en cultivo. Los andamios 3D se estabilizan mediante la interconexión de los microgeles inyectables recocidos debido a enlaces covalentes o supramoleculares, lo que resulta en construcciones robustas y definidas para el cultivo celular 2,3,5,7,8.

La microfluídica se ha establecido como uno de los métodos más precisos y adaptables para la preparación de hidrogeles granulares definidos⁹. La posibilidad de producir mayores cantidades de los bloques de construcción requeridos en un proceso continuo mientras se mantiene su monodispersidad química, mecánica y física contribuye sustancialmente a la idoneidad de este proceso. Además, el tamaño y la forma de los microgeles producidos pueden manipularse mediante diversos métodos, como emulsiones discontinuas, microfluídica, litografía, pulverización electrodinámica o fragmentación mecánica, que determinan la geometría de los bloques de construcción y, por lo tanto, la estructura 3D del andamio final ^1,10.

Recientemente, el concepto de andamios 3D macroporosos compuestos por varillas de microgel funcionalizadas que se entrelazan rápidamente en soluciones acuosas sin aditivos adicionales ha sido reportado¹¹. La anisotropía de las varillas de microgel resultó en mayores porosidades y distribuciones de poros con mayores tamaños de poro en comparación con el empleo de microgeles esféricos en este estudio¹¹. De esta manera, menos material crea poros más grandes con una variedad de geometrías de poros diferentes, manteniendo la estabilidad del andamio 3D. El sistema consiste en dos tipos de barras de microgel con grupos funcionales complementarios de amina primaria y epoxi que se consumen dentro de la reacción de interconexión cuando entran en contacto entre sí. Los grupos funcionales que no participan en el proceso de interconexión permanecen activos y pueden utilizarse para la post-modificación selectiva con péptidos adhesivos celulares u otros factores bioactivos. Las células de fibroblastos se adhieren, se propagan y proliferan cuando se cultivan dentro de los andamios 3D, creciendo primero en la superficie del microgel y llenando la mayoría de los macroporos después de 5 días. Un estudio preliminar de cocultivo de fibroblastos humanos y células endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVECs) mostró resultados prometedores para la formación de estructuras similares a vasos dentro de los andamios 3D interconectados¹¹.

Protocol

1. Material y preparaciones necesarias para microfluídica Para el procedimiento microfluídico descrito, use jeringas de vidrio y bombas de jeringa de 1 ml y 5 ml. La formación de gotitas en chip se observa a través de un microscopio invertido equipado con una cámara de alta velocidad. Cree el diseño del chip microfluídico (Figura 1B) utilizando un software de diseño asistido por computadora y produzca una plantilla maestra como ya se informó<sup …

Representative Results

Figura 2: Estructura del andamio reticulado macroporoso. (A) Proyección 3D de una pila Z de microscopía confocal de 500 μm del andamio macroporoso interconectado. La barra de escala representa 500 μm. (B) Andamio interconectado compuesto por ~10,000 varillas de microgel en un vidrio de cubierta tomado directamen…

Discussion

Uno de los pasos críticos en este protocolo es la calidad del metacrilato de 2-aminoetilo (AMA) utilizado como comonómero para la funcionalización de aminas primarias. El AMA debe ser un polvo de grano fino y preferiblemente incoloro entregado en un recipiente de vidrio marrón hermético al gas. Se debe evitar el uso de material verdoso y grumoso, ya que perjudica significativamente la reacción de gelificación y afecta negativamente la reproducibilidad de los resultados. En caso de mala gelificación y varillas de …

Materials

ABIL EM 90	Evonik	144243-53-8	non-ionic surfactant
2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride	TCI Chemicals	A3413	>98.0%(T)(HPLC)
8-Arm PEG-acrylate 20 kDa	Biochempeg Scientific Inc.	A88009-20K	≥ 95 %
AutoCAD 2019	Autodesk		computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs
CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter	CHROMAFILCarl Roth GmbH+Co.KG	XH49.1	pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV)
Cover glass	Marienfeld-Superior		type No. 1
EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm	Electron Microscopy Sciences		0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter
Ethanol absolut	VWR Chemicals
FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera	FLIR Systems
Fluoresceinamine isomer I	Sigma-Aldrich	201626
Fluorescein isothiocyanate	Thermo Fisher Scientific	46424
25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles	BD Microlance 3
Glycidyl methacrylate	Sigma-Aldrich	779342	≥97.0% (GC)
GRGDS-PC	CPC Scientific	FIBN-015A
Hamilton 1000 Series Gastight syringes	Thermo Fisher Scientific	10772361/10500052	PFTE Luer-Lock
Hexane	Sigma-Aldrich	1,04,367
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate	Sigma-Aldrich	900889	≥95 %
Motic AE2000 trinocular microscope	Ted Pella, Inc.	22443-12
Novec 7100	Sigma-Aldrich	SHH0002
Oil Red O	Sigma-Aldrich	O9755
Paraffin	VWR Chemicals	24679320
Pavone Nanoindenter Platform	Optics11Life
Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	AM9624
Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade	dropletex		ID 0.38 mm OD 1.09 mm
2-Propanol	Sigma-Aldrich	190764	ACS reagent, ≥99.5%
Protein LoBind Tubes	Eppendorf	30108132
Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump	Harvard Apparatus
RPMI 1640 medium	Gibco	11530586
SYLGARD 184 silicone elastomer kit	Dow SYLGARD	634165S
Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane	Sigma-Aldrich	448931
UVC LED sterilizing box	UVLED Optical Technology Co., Ltd.	9S SZH8-S2