Onderling verbonden macroporeuze 3D-steigers van Microgel-staven
Summary
Microgelstaven met complementaire reactieve groepen worden geproduceerd via microfluïdica met het vermogen om in waterige oplossing met elkaar te verbinden. De anisometrische microgels binden en verbinden zich tot stabiele constructies met grotere poriën in vergelijking met op bolvormige systemen gebaseerde systemen. Microgels gemodificeerd met GRGDS-PC vormen macroporeuze 3D-constructies die kunnen worden gebruikt voor celkweek.
Abstract
Een tweecomponentensysteem van gefunctionaliseerde microgels uit microfluïdica maakt snelle koppeling in 3D-macroporeuze constructies in waterige oplossingen mogelijk zonder verdere additieven. Continue gefoto-geïnitieerde on-chip gelation maakt variatie van de microgel-beeldverhouding mogelijk, die de eigenschappen van de bouwsteen voor de verkregen constructies bepaalt. Glycidylmethacrylaat (GMA) of 2-aminoethylmethacrylaat (AMA) monomeren worden gecopolymeriseerd in het microgelnetwerk op basis van polyethyleenglycol (PEG) sterpolymeren om epoxy- of aminefunctionaliteit te bereiken. Een focusoliestroom wordt in de microfluïdische uitlaatstructuur geïntroduceerd om een continue verzameling van de gefunctionaliseerde microgelstaven te garanderen. Op basis van een recente publicatie resulteren op microgelstaaf gebaseerde constructies in grotere poriën van enkele honderden micrometers en tegelijkertijd tot een algehele hogere stabiliteit van de steiger in vergelijking met een bolvormig model. Op deze manier is het mogelijk om constructies met een hoger volume te produceren met een vrijer volume en tegelijkertijd de benodigde hoeveelheid materiaal te verminderen. De onderling verbonden macroporeuze steigers kunnen worden opgepakt en vervoerd zonder schade of desintegratie. Amine- en epoxygroepen die niet betrokken zijn bij het onderling verbinden blijven actief en kunnen onafhankelijk worden gebruikt voor post-modificatie. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode voor de fabricage van microgelstaven om macroporeuze onderling verbonden steigers te vormen die kunnen worden gebruikt voor volgende celexperimenten.
Introduction
Om complex gedrag van coöperatieve cellen in 3D-constructies te bestuderen, moeten steigerplatforms consistente prestaties in reproduceerbaarheid vertonen, een geschikte geometrie hebben voor celmigratie en tegelijkertijd een zekere flexibiliteit bieden in termen van parameterverandering om hun invloed op het levende weefsel te onderzoeken1. In de afgelopen jaren heeft het concept van macroporeuze gegloeide deeltjes (MAP), voor het eerst beschreven door Segura et al., zich ontwikkeld tot een efficiënt en veelzijdig platform voor 3D-steigerproductie2. De op maat gemaakte samenstelling van de microgels, die de bouwstenen zijn van de uiteindelijke 3D-steiger, definieert eigenschappen zoals de stijfheid van het construct, de selectieve chemische reactiviteit van het gelnetwerk en de uiteindelijke poriegrootte van de steiger 2,3,4,5,6. Cellijmpeptiden als aanwijzingen voor scaffold-celinteracties worden opgenomen in het polymeernetwerk van de microgels om celaanhechting mogelijk te maken en kunnen worden gevarieerd om hun specifieke effecten op cellen in cultuur te onderzoeken. De 3D-steigers worden gestabiliseerd door de gegloeide injecteerbare microgels onderling te koppelen als gevolg van covalente of supramoleculaire bindingen, wat resulteert in robuuste en gedefinieerde constructies voor celkweek 2,3,5,7,8.
Microfluïdica heeft zich gevestigd als een van de meest nauwkeurige en aanpasbare methoden voor de bereiding van gedefinieerde granulaire hydrogels9. De mogelijkheid om grotere hoeveelheden van de vereiste bouwstenen in een continu proces te produceren met behoud van hun chemische, mechanische en fysische monodispersiteit draagt aanzienlijk bij aan de geschiktheid van dit proces. Bovendien kunnen de grootte en vorm van de geproduceerde microgels worden gemanipuleerd door verschillende methoden zoals batch-emulsies, microfluïdica, lithografie, elektrodynamisch spuiten of mechanische fragmentatie, die de geometrie van de bouwstenen bepalen en dus de 3D-structuur van de uiteindelijke steiger 1,10.
Onlangs is het concept van macroporeuze 3D-steigers die zijn samengesteld uit gefunctionaliseerde microgelstaven die snel met elkaar verbonden zijn in waterige oplossingen zonder verdere additieven gemeld11. De anisotropie van microgelstaven resulteerde in hogere porositeiten en porieverdelingen met grotere poriegroottes in vergelijking met het gebruik van bolvormige microgels in deze studie11. Op deze manier creëert minder materiaal grotere poriën met een verscheidenheid aan verschillende poriegeometrieën met behoud van de stabiliteit van de 3D-steiger. Het systeem bestaat uit twee soorten microgelstaven met complementaire primaire amine- en epoxyfunctiegroepen die binnen de onderling verbonden reactie worden verbruikt wanneer ze met elkaar in contact komen. De functionele groepen die niet deelnemen aan het interlinkingproces blijven actief en kunnen worden gebruikt voor selectieve postmodificatie met cellijmpeptiden of andere bioactieve factoren. Fibroblastcellen hechten, verspreiden en vermenigvuldigen zich wanneer ze in de 3D-steigers worden gekweekt, eerst op het microgeloppervlak groeien en de meeste macroporiën na 5 dagen vullen. Een voorlopige co-kweekstudie van menselijke fibroblasten en menselijke navelstreng endotheelcellen (HUVECs) toonde veelbelovende resultaten voor de vorming van vaatachtige structuren binnen de onderling verbonden 3D-steigers11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een van de kritieke stappen in dit protocol is de kwaliteit van het 2-aminoethylmethacrylaat (AMA) dat wordt gebruikt als comonomeer voor primaire aminefunctionalisatie. De AMA moet een fijnkorrelig en bij voorkeur kleurloos poeder zijn dat wordt afgeleverd in een gasdichte bruine glazen container. Men moet het gebruik van groenachtig en klonterig materiaal vermijden, omdat het de gelation-reactie aanzienlijk schaadt en de reproduceerbaarheid van de resultaten negatief beïnvloedt. In het geval van slechte gelatatie en o…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We drukken onze dankbaarheid uit aan de coauteurs van ons eerdere werk waarop deze methodologie is gebaseerd, Céline Bastard, Luis P. B. Guerzoni, Yonca Kittel, Rostislav Vinokur, Nikolai Born en Tamás Haraszti. We zijn dankbaar voor de financiering van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) binnen het project B5 en C3 SFB 985 “Functionele microgels en microgelsystemen”. We erkennen financiering van de Leibniz Senate Competition Committee (SAW) onder het Professorinnenprogramm (SAW-2017-PB62: BioMat). We erkennen oprecht de financiering van de Europese Commissie (EUSMI, 731019). Dit werk werd gedeeltelijk uitgevoerd in het Center for Chemical Polymer Technology (CPT), dat werd ondersteund door de EU en de deelstaat Noordrijn-Westfalen (subsidie EFRE 30 00 883 02).
Materials
| ABIL EM 90 | Evonik | 144243-53-8 | non-ionic surfactant |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride | TCI Chemicals | A3413 | >98.0%(T)(HPLC) |
| 8-Arm PEG-acrylate 20 kDa | Biochempeg Scientific Inc. | A88009-20K | ≥ 95 % |
| AutoCAD 2019 | Autodesk | computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs | |
| CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter | XH49.1 | pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV) | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | type No. 1 | |
| EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm | Electron Microscopy Sciences | 0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter | |
| Ethanol absolut | VWR Chemicals | ||
| FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera | FLIR Systems | ||
| Fluoresceinamine isomer I | Sigma-Aldrich | 201626 | |
| Fluorescein isothiocyanate | Thermo Fisher Scientific | 46424 | |
| 25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles | BD Microlance 3 | ||
| Glycidyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 779342 | ≥97.0% (GC) |
| GRGDS-PC | CPC Scientific | FIBN-015A | |
| Hamilton 1000 Series Gastight syringes | Thermo Fisher Scientific | 10772361/10500052 | PFTE Luer-Lock |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 1,04,367 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Sigma-Aldrich | 900889 | ≥95 % |
| Motic AE2000 trinocular microscope | Ted Pella, Inc. | 22443-12 | |
| Novec 7100 | Sigma-Aldrich | SHH0002 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O9755 | |
| Paraffin | VWR Chemicals | 24679320 | |
| Pavone Nanoindenter Platform | Optics11Life | ||
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade | dropletex | ID 0.38 mm OD 1.09 mm | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 30108132 | |
| Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | ||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11530586 | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow SYLGARD | 634165S | |
| Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| UVC LED sterilizing box | UVLED Optical Technology Co., Ltd. | 9S SZH8-S2 |
References
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1800160 (2018).
- Truong, N. F., et al. Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer. Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Hsu, R. -. S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
- Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254 (2017).
- Chen, Z., et al. Advanced microfluidic devices for fabricating multi-structural hydrogel microsphere. Exploration. 1 (3), 20210036 (2021).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
- Rommel, D., et al. Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture. Advanced Science. 9 (10), 2103554 (2022).
- Guerzoni, L. P. B., et al. Cell encapsulation in soft, anisometric poly(ethylene) glycol microgels using a novel radical-free microfluidic system. Small. 15 (20), 1900692 (2019).
- Krüger, A. J. D., et al. Compartmentalized jet polymerization as a high-resolution process to continuously produce anisometric microgel rods with adjustable size and stiffness. Advanced Materials. 31 (49), 1903668 (2019).
- Darling, N. J., et al. Click by click microporous annealed particle (MAP) scaffolds. Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391 (2020).
- Lutzweiler, G., Ndreu Halili, ., Engin Vrana, N. The overview of porous, bioactive scaffolds as instructive biomaterials for tissue regeneration and their clinical translation. Pharmaceutics. 12 (7), 602 (2020).
- Dang, H. P., et al. 3D printed dual macro-, microscale porous network as a tissue engineering scaffold with drug delivering function. Biofabrication. 11 (3), 035014 (2019).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
